克罗卡林对急性脑缺血再灌注大鼠的脑保护作用

冯 涛 娄季宇 白宏英 杨霄鹏 曾志磊 王金兰

郑州大学第二附属医院神经内科 郑州 450014

脑缺血再灌注后损伤是引起缺血性脑血管病（ischemic cerebrovascular disease，ICVD）脑功能损害的重要原因。已知很多因素参与再灌注后损伤的过程，其中炎症反应促进了继发性脑损伤。小胶质细胞（microglia，MG）是脑内的主要免疫效应细胞，生理状况下它对维持脑内环境稳态起重要作用，当脑内发生病理损害时迅速激活产生大量神经毒性因子，加速神经元的死亡。K－ATP通道开放剂Cromakalin以细胞内的ATP/ADP水平为门控因素、非电压依赖性的特殊钾离子通道，广泛存在中枢神经系统内。它的激活是机体缺血缺氧状态下的自我保护机制，可以对抗损害因子对机体的伤害，若早期用开放剂打开这类通道，可以减轻脑缺血缺氧对神经元的损害。

本研究旨在利用大鼠MCAO模型，观察大鼠急性脑缺血再灌注后海马区CA1区OX42、iNOS的表达情况，神经元特异性尼氏染色法检测神经元数目及Cromakalin干预后的变化，为K－ATP通道开放剂尽早应用于临床治疗ICVD提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器SD大鼠由郑州大学实验动物中心提供。图像采集：德国Lecia显微照像系统。Cromakalin，Sigma美国。分析系统：上海山富科学仪器有限公司，Biosens Digital Imaging。System v1.6。OX42、iNOS抗体：北京中杉生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组：72只雄性SD大鼠，体质量（220±30）g随机分为3组：A组为假手术组，B组为单纯缺血再灌注组，C组为克罗卡林干预组，每组24只分6h、24h、72h、7d时间点，每个时间点各6只。

1.2.2 动物模型制备：应用改良Zea Longa线栓法制备大鼠MCAO模型。大鼠苏醒后参照Zea Longa 5分制标准［1］进行神经行为学评分，1～3分动物入选。

1.2.3 动物处理：C组在MCAO后2h给予Cromakalin 0.4mg/（kg·d），2mL腹腔注射，B组在MCAO后2 h给予生理盐水2 m L腹腔注射，A组除了不插入线栓其他同B组。达各时间点后，用10％水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，用生理盐水和4％多聚甲醛进行心脏灌注固定，取脑，制作脑部冠状石蜡切片（厚度4μm）。采用免疫组化染色（SP法），检测CA1区OX42、iNOS的表达情况。各组取7d时间点进行海马CA1区神经元尼氏染色，每组取6张切片，在400倍视野下计数神经元。

1.3 统计学方法实验的数据采用均数±标准差（±s）表示，应用SPSS10.0统计软件对实验数据进行统计分析，多组均数间的比较采用单因素方差分析（one－way，ANOVA），均数间的两两比较采用LSD检验，以α＝0.05作为显著性检验水准。

2 结果

2.1 海马CA1区OX42的表达情况A组、B组、C组各时间点海马CA1区OX42均有表达，A组4个时间点OX42变化不明显，B、C两组OX426h开始表达，24 h明显增多，72h达高峰，7d仍有表达，明显高于A组各时间点（P＜0.05），C组时间点表达均少于B组（P＜0.05）。结果见表1。

表1 各时间点海马CA1区OX－42的平均积分光密度的变化±s）

表1 各时间点海马CA1区OX－42的平均积分光密度的变化±s）

注：▼与 A组相比，P＜0.01；▽与B组相比，P＜0.01

组别6 h 24 h 72 h 7 d A组 95.93±3.03 102.08±4.26 106.27±8.32 100.39±2.92 B组 131.76±5.19▼ 155.73±6.49▼ 174.77±8.09▼147.14±11.87▼C组 118.64±6.36▼▽140.13±4.35▼▽144.13±5.51▼▽123.93±8.47▼▽

2.2 海马CA1区iNOS表达情况A组、B组、C组各时间点海马CA1区iNOS均有表达，A组4个时间点iNOS变化不明显，B、C两组6 h开始表达，24 h明显增多。72 h达高峰，7 d仍有表达，明显高于A组各时间点（P＜0.05）。C组各时间点表达均少于B组（P＜0.05）。结果见表2。

表2 各时间点海马CA1区iNOS的平均积分光密度的变化±s）

表2 各时间点海马CA1区iNOS的平均积分光密度的变化±s）

注：▼与A组相比，P＜0.01；▽与B组相比，P＜0.01

组别6 h 24 h 72 h 7 d A组 93.52±4.16 100.24±6.84 103.38±4.88 98.50±3.72 B组 127.47±3.77▼ 161.97±8.29▼170.86±10.21▼ 146.66±5.97▼C组 115.05±8.27▼▽133.64±7.59▼▽142.43±4.82▼▽121.60±5.97▼▽

2.3 海马CA1区神经元变化情况A组神经元（60.66±6.62）个，B组神经元（11.50±3.08）个，即在大鼠缺血再灌注7d时，海马CA1区神经元的死亡数目是原有数目的81.1％，存活数目是原有数目的18.9％。C组神经元（29.33±4.88）个，即在大鼠缺血再灌注7d时，海马CA1区神经元存活数目是原有数目的48.4％，即保护了29.5％的神经元免于死亡。三组之间差异有明显统计学意义（P＜0.05），结果见表3。

表3 神经元尼氏染色±s，个/400倍视野）

表3 神经元尼氏染色±s，个/400倍视野）

注：▼与A组相比，P＜0.01；▽与B组比，P＜0.01

组别 n 神经元数目A组6 60.66±6.62 B组 6 11.50±3.08▼C组 6 29.33±4.88▼▽

3 讨论

近些年来随着影像学在神经科的广泛应用，特别是头颅MRI及DWI在临床的广泛应用，急性脑梗死后2h内即可在影像学上发现缺血病灶，为临床上早期溶栓治疗提供了可靠的依据，脑缺血再灌注损伤也是不能避免［2］。再灌注损伤涉及到多个病理生理环节，其中炎症反应促进了继发性脑损，是缺血再灌注损伤的重要原因之一。在哺乳动物中，海马CA1区神经元是脑部缺血容易损伤的区域之一，所以海马CA1是研究者经常选择观测脑部病理变化的区域之一。

MG在颅内分布比较广泛，是颅内的主要免疫效应细胞，大约占胶质细胞的5％～20％［3］。在生理状态下对神经元有营养、支持、保护等重要作用，对颅内环境有免疫监视和宿主防御的作用。同时MG对颅内的内环境改变及其敏感，特别是感染和创伤时迅速被激活，形态上由静息时的分支状到活化的阿米巴样，细胞胞体增大，并产生大量的神经毒性因子，对神经元产生毒性作用，加重对脑部的损害。因此抑制MG的过度激活，具有脑保护作用。另激活的MG是iNOS的主要来源。iNOS是人体内一种重要的合酶，在生理条件下并不表达，只在病理情况下如脑缺血再灌注损伤时，iNOS可以出现在炎性细胞、神经元、神经胶质细胞及微血管内皮细胞中，一旦诱导合成，就持续大量产生一氧化氮（NO）。NO是一种化学性质活泼的自由基，兼有细胞毒性作用，过量持续的表达是脑缺血再灌注损伤的一个重要因素，因此iNOS是脑缺血再灌注损伤产生过量NO的基础。

K－ATP通道是1983年Noma［4］首先发现存在于豚鼠心肌细胞膜上，现已经证明它也广泛存在中枢神经系统中，同样也存在小胶质细胞上。在正常生理状态下脑内的K－ATP通道处于关闭状态，当机体出现缺血缺氧、炎症反应等时，KATP通道开放，钾离子大量外流，细胞出现超极化状态，神经元的兴奋性降低，调节钙离子的平衡，稳定线粒体膜电位，抑制凋亡等，是机体的一种重要自我保护机制。本实验观察应用K－ATP通道开放剂Cromakalin干预大鼠脑缺血再灌注后不同时间点OX42、iNOS表达的变化，发现应用Cromakalin干预后，OX42、iNOS的表达明显低于脑缺血再灌注组，海马CA1区神经元存活数目Cromakalin干预组明显多于非干预组。说明K－ATP通道开放剂Cromakalin可通过抑制小胶质细胞的过度激活、iNOS的过度表达，保护脑缺血大鼠海马CA1区神经元迟发性死亡等方面保护神经元，从而起到脑保护的作用。

［1］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（l）：84－91.

［2］李建章，主编.神经科医师手册［M］.北京：人民卫生出版社，2010：161－183.

［3］彭玲梅，黄泳.小胶质细胞在阿尔茨海默病炎性反应中的双重作用［J］.医学综述，2009，15（19）：2 889－2 890.

［4］Noma A.ATP－regulated K＋channels in cardiac muscle［J］.Natuer，1983，305（5930）：147－148.