四种方法检测广西奶水牛结核病的比较

谢志勤 ，谢芝勋 ，刘加波 ，庞耀珊 ，邓显文 ，谢丽基 ，温 娟 ，蓝如束 ，张振荣 ，黄海强

（1.广西兽医研究所，广西 南宁 530001；2.广西南宁市动物疾病预防诊断中心，广西 南宁 530001；3.广西壮族自治区疾病预防控制中心，广西 南宁 530028；4.广西武宣动物疾病预防诊断中心，广西 武宣 545900）

牛结核病（Bovine tuberculosis）主要是由牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）引起的一种慢性进行性传染病。近年来，随着结核分枝杆菌耐药性菌株的产生及养牛的增加，结核病的阳性检出率也在逐年上升，每年给畜牧业生产造成巨大损失，目前世界范围内有5000万头牛感染了结核，造成的经济损失每年达30亿美元[1]。牛分枝杆菌可以传染给人，危害人类健康。据报道，人结核病人中约有30%是由牛结核分枝杆菌引起。每年因死于结核病的人数在世界范围内就300万，是其他传染病死亡人数之和[2]。目前牛结核病在广大发展中国家仍严重流行，我国牛结核的阳性率为10%左右。尽管采取了“检疫、扑杀”的防制策略，但仍未能达到从根本上控制牛结核病的目的，近年来反而呈上升趋势[3]。

在检测牛结核病方面，目前已有多种不同的检测方法，如变态反应、分离鉴定、ELISA[4]、PCR 检测[5]等。应用较多的则是传统诊断方法，即采用结核菌素皮试（tuberculin skin test，TST）检测，通过皮下注射牛分枝杆菌的纯化蛋白衍生物（Purified protein derivative，PPD）造成迟发性变态反应进行判断。PCR检测方法是近几年发展起来的一种快速检测方法，在疾病的诊断上已得到广泛的应用。虽然在检测牛结核方面有多种方法，但是对各个方法的检测准确性没有进行比较。本试验试图通过应用牛结核变态反应、分离鉴定、PCR检测和γ-干扰素检测四种方法对牛群进行比较，探寻这四种检测方法的优缺点及在实际工作中的应用价值，以找出结核病污染群的最佳防治和净化方法，更好地防制水牛结核病，减少人类结核病的发生。

1 材料与方法

1.1 试验及采样奶水牛场

在广西南宁、武宣、来宾、武鸣、合浦等不同地方的奶水牛场进行试验及采样。

1.2 试剂盒和牛型提纯结核菌素

牛结核菌素购自兽药集团生物疫苗有限公司（原黑龙江省生物制品一厂）产品，批号为200404，规格为5mL/瓶，冻干型；γ-干扰素试剂盒购自北京测迪科技有限公司，为进口产品，批号为63319。

1.3 主要试剂

Taq 聚合酶、dNTPs、DNA Marker购自大连宝生生物工程有限公司；蛋白酶K购自Merker公司；十二烷基磺酸钠（SDS）为Promega公司；其他试剂均为进口或国产分析纯试剂。

1.4 菌种

牛分枝杆菌C680001灭活菌、牛分枝杆菌BCG抗原，购自中国兽医药品监察所，牛分枝杆菌分离株mt 359为本室分离并保存。

1.5 培养基

改良罗氏培养基（L-J氏培养基）和丙酮酚培养基按结核病细菌学常规技术进行配制。鉴别培养基噻吩羧酸肼（T2H）培养基及对硝基甲酸培养基（PNB）则由广西疾病控制中心结核病科惠赠。

1.6 牛结核变态反应试验及判定标准

按规程GB/T18645-2002进行试验和判定标准进行判定。

1.7 临床样品的采集及处理

用灭菌的棉拭子从牛的鼻腔中挑取鼻黏液，然后用经高压灭菌的PBS将鼻黏液从棉拭子中洗下来；淋巴结的处理按1:5（W/V）加灭菌的PBS进行研磨。分别取1.5mL上述的鼻黏液洗液、淋巴结研磨液和牛奶样品到1.5mL离心管，12000 r/min离心10min，弃上清，沉淀用灭菌的PBS溶液洗涤并离心2次，然后按已报道的方法[6]进行处理和提取核酸DNA。

1.8 分离培养

1.8.1 培养基接种

将已处理的鼻黏液、淋巴结和牛奶样品接种L-J氏培养基、丙酮酚培养基。接种后置37℃温箱平放培养，3 d后直立，继续培养，观察菌落的颜色、形状大小等生长情况。

1.8.2 涂片镜检及鉴别培养

将可疑菌落用萋-尼氏抗酸性染色，染色镜检后凡为分枝杆菌阳性的细菌，转管至L-J氏培养基进行纯培养。然后用灭菌的PBS溶液洗下来，按1:100稀释，然后分别接种于噻吩羧酸肼（T2H）培养基和对硝基苯甲酸培养基（PNB）。

1.9 γ-干扰素试验

1.9.1 采血

采集单次皮内试验阳性牛3～30天内的血液。将采集的血液（至少5mL）放入肝素抗凝管中，轻轻颠倒几次混合血液，使肝素溶解。室温（22±5℃）下运送到实验室并在采血后30 h内进行培养。培养前轻轻颠倒试管，充分混匀血液样品。将抗凝血加入24孔组织培养板，每头动物加三管1.5mL分装的抗凝血，放37℃培养16～24 h。

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1.9.2 γ-干扰素试验

吸取经刺激抗原（PBS、禽PPD或牛PPD）刺激后约400μL的上层血浆，转入独立的1.5mL离心管中，然后按γ-干扰素试验试剂盒说明书进行操作。

1.9.3 γ-干扰素试验判定标准

按γ-干扰素试验试剂盒提供判定标准，阳性为牛型提纯结核菌素的OD-阴性抗原的OD≥0.1且牛型提纯结核菌素的OD-禽型提纯结核菌素的OD≥0.1。阴性为牛型提纯结核菌素的OD-阴性抗原的OD<0.1或牛型提纯结核菌素的OD-禽型提纯结核菌素的OD<0.1。

1.10 PCR检测

1.10.1 引物设计与合成

牛分枝杆菌的引物根据基因库牛分枝杆菌特异性基因（No.MBU87961，gi9954088）设计，上游引物 XZmbss5:5'-CTC TGA AAT TCG CCT CTG TAG-3'，下游引物XZmbss65'-TCC GTC TGC ACA CCT TGT GC-3'，设计扩增片段大小为631 bp。引物由大连宝生生物工程有限公司合成。

1.10.2 核酸DNA抽提

DNA的提取参照已报道方法[6]进行。

1.10.3 PCR扩增

按已报道方法[6]进行。反应程序为94℃预变性5min，然后进入94℃1min，56℃ 1min，72 ℃ 1min，共进行35个循环；72℃延伸10min，最后于4℃停止。

2 结果

2.1 变态反应检测结果

本试验共检测1850头奶水牛，根据牛变态反应国家标准进行判断，检测阳性水牛78头，阳性率为4.21%，其中广西南宁检测720头，检出阳性牛28头；武宣350头，检出阳性牛18头；来宾200头，检出阳性牛7头；武鸣80头，检出阳性牛5头；合浦500头，检出阳性牛20头，结果见表1。

2.2 牛分枝杆菌的分离

从78头皮内变态反应阳性牛采集的样品中进行结核分枝杆菌分离，共分离到13株菌，13株菌经抗酸染色后进行镜检，镜检为阳性的菌转移到鉴别培养基进行鉴别培养，根据在鉴别培养基上的生长情况鉴定出2株为牛分枝杆菌，其余都为非典型分枝杆菌，结果见表2。

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2.3 PCR扩增

提取78头结核变态反应阳性牛样品的DNA，然后应用PCR方法进行扩增，扩增结果有4份样品为牛分枝杆菌阳性，其余都为阴性。同样对分离的13株菌的DNA也进行了PCR扩增鉴定，结果有2株为牛分枝杆菌阳性（图1）。

2.4 γ-干扰素ELISA检测

采集78头结核变态反应阳性牛血液，放入含有抗凝剂的试管中，然后对血样进行γ-干扰素培养；培养后取上清应用γ-干扰素ELISA检测试剂盒进行检测，根据判定结果判定有5份为牛分枝杆菌阳性，其余均为阴性。

2.5 变态反应、分离鉴定、PCR和γ-干扰素检测阳性数的比较

对1850头来自不同牛场的奶水牛进行变态反应检测，共检出阳性牛78头，阳性检出率为4.21%（78/1850）；从78头检测阳性牛的样品中经分离并鉴定为牛分枝杆菌有2头，阳性分离率为 2.56%（2/78），为全群的 0.11%（2/1850）；PCR 方法检出阳性4头，阳性检出率是为5.12%（4/78），为全群的 0.22%（4/1850）；而γ-干扰素ELISA检测阳性5头，阳性检出率为6.41%（5/78），为全群的0.27%（5/1850）。变态反应的阳性检出率远高于PCR、γ-干扰素检测和细菌分离鉴定的检出率（见表3）。

2.6 变态反应、PCR方法、γ-干扰素检测和分离鉴定之间的关系

78头变态反应阳性牛，经细菌学鉴定牛分枝杆菌阳性有2头，PCR检测阳性牛有4头，γ-干扰素ELISA检测阳性有5头。变态反应、PCR、γ-干扰素ELISA与分离鉴定的符合率分别为2.56%、50%和40%，γ-干扰素ELISA检测和PCR检测与细菌分离鉴定的检出率较接近。

3 讨论

本试验中，皮内变态反应的阳性检出率为4.21%，分离鉴定为0.11%；PCR方法为0.22%，而γ-干扰素ELISA方法则为0.27%。从四种检测结果中不难发现，变态反应的阳性检出率比分离鉴定、PCR方法和γ-干扰素ELISA方法的阳性检出率高，这是因为:其一是与结核变态反应的特异性差有关。本试验从变态反应阳性的78份样品中只分离出13株菌，且已证明13株菌中有11株为非典型分枝杆菌，也就是说非典型分枝杆菌的存在可以影响变态反应的检测结果，造成假阳性。这一结果进一步验证了张喜悦[7]和Lodes[8]报道的牛结核变态反应易受人为因素的影响和非典型分枝杆菌感染及患有寄生虫病等非特异性因素的干扰。其二是检测牛处于牛结核发病初期或隐性期即细胞免疫期，此时变态反应阳性检出率要比其它三种方法高；其三是与奶水牛的皮厚有关，由于奶水牛的皮厚要比黄牛、黑白花奶牛的厚，对结核菌素刺激要比黄牛、黑白花奶牛敏感，应用现有牛的判定标准来判定，可能会导致阳性率过高。

本试验中，变态反应与分离培养的符合率很低，只有2.56%。这是因为结核分枝杆菌是胞内寄生菌，受机体的机能影响，当机体的抵抗力强时，限制了结核菌在体内的增殖、扩散，此时细胞免疫是主要的；当机体抵抗力弱时，病原体向周围扩散，进入血液和体液中，病原体刺激机体产生大量抗体[9]，此时应以检测病原为主。变态反应主要是针对细胞免疫期牛结核的检测[10]，而分离鉴定是针对病原的鉴别检测。因此，变态反应与分离培养的符合率较低是符合理论的。

本试验中，PCR方法、γ-干扰素ELISA方法与分离培养的符合率也不高，分别只有50%和40%，但比较接近。这是由于PCR方法是对牛分枝杆菌的病原核酸进行检测，不管是活菌还是已死亡的分枝杆菌都能进行检测，具有较高的敏感性[11]；γ-干扰素ELISA方法也是对病原进行检测，主要是对致敏的淋巴细胞分泌的γ-干扰素进行检测。致敏淋巴细胞在体外培养的条件下，接受特异性抗原（如PPD等）刺激而活化、表达并分泌γ-干扰素，再以ELISA对培养上清中的γ-干扰素进行测定从而达到检测，这种方法同样具有较高的敏感性[12]。而分离鉴定主要是对活体病原进行体外增值并鉴定，对已死亡的分枝杆菌是不能应用培养基进行分离的，因此在实际检测中，PCR方法、γ-干扰素ELISA方法与分离培养的符合率不高也是正常的。

综上所述，牛结核变态反应虽然特异性差，易受各种因素的影响，靠单纯的变态反应试验并不能最终确定为结核病牛，但对于检测早期或刚感染牛结核病的牛，还是起到很大的作用，可以为进一步的检测确认带来方便，减少检测的盲目性。而分离鉴定虽然是最准确的一种诊断方法，但是它有一定的局限性，对样品要求高，存在鉴定周期长、繁琐、对人威胁大，易受人为或其它环境因素的影响等不足，不利于对牛结核病的快速检测。而PCR方法和γ-干扰素检测方法与分离鉴定的符合率最接近，二者具有较高的特异性和敏感性。应用PCR方法或γ-干扰素检测方法来进行牛结核病的检测，不但可以提高检测的准确性，还可以加快检测的速度，在实际中可以作为皮内变态反应的补充检测。因此，在对牛群进行牛结核检测时，应首先进行变态反应检测，检测阳性即采取隔离，然后结合PCR检测方法或γ-干扰素ELISA检测方法来综合判断，两者检测阳性的牛应及时予以淘汰，这样经过多次检测淘汰，最终达到净化牛结核病的目的。

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