羟乙基淀粉130/0.4不同复苏方案对失血性休克大鼠肺损伤的早期影响及机制

刘华琴，李 勇，刘向东，邢玉英，付建峰，王士杰

容量治疗是失血性休克的主要治疗措施之一。在血源紧张或匮乏的情况下，血浆扩容剂的选择要考虑在满足重要器官有效灌注的前提下，降低肺、肾等易损脏器的程度。6%羟乙基淀粉(hydroxyethyl starch，HES)130/0.4是目前最接近理想状态的扩容剂［1］，日益广泛的应用于各种休克患者的容量治疗。失血性休克后急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是导致患者死亡的主要原因。研究表明晶体液和全血复苏能纠正失血性休克患者血容量的丢失，增加心脏的充盈量和每搏量，减少血管活性药的用量，维持有效的动脉血压;但高达80% ～85%患者出现乳酸血症及混合静脉血氧饱和度降低，表明血压、心率，尿量等回复正常，但肺组织等的低灌注仍未得到改善［2］。HES130/0.4能更好的改善微循环，能减轻内毒素性肺损伤［3～6］，但对失血性休克后非感染性肺部炎性损伤的作用尚无定论。本研究通过动脉放血法复制失血性休克模型，观察不同剂量的HES130/0.4复合林格液复苏对大鼠ALI的早期影响及外周血白细胞CD11b和CD18的表达加以探讨。

1 材料与方法

1.1 动物分组 健康清洁级♂成年SD大鼠24只，体重220～300 g，河北医科大学动物中心提供。实验前12 h禁食，2 h禁饮，实验室温度控制在20℃～23℃，相对湿度0.45～0.55，环境清洁。24只SD大鼠随机分为假手术组(sham组)、林格液组(RS组)、HES 33 ml·kg－1复苏组(H1 组)、HES 50 ml·kg－1复苏组(H2 组)，每组6 只。

1.2 试剂 6%羟乙基淀粉130/0.4(批号:TM7302，Fresenius公司，德国)，FITC 标记的抗CD11b和抗CD18抗体，FITC标记的小鼠 IgGk和IgA1以及溶血素(BD公司，美国)。

1.3 失血性休克模型的复制 腹腔注射1%戊巴比妥钠45 mg·kg－1麻醉后分离右颈总动脉、左股静脉。左股静脉连接24号套管针输液用，右颈总动脉置入连有三通的22号套管针连接SurgiVet®监护仪(V9200型，美国)，供放血和监测血压。动、静脉穿刺成功后，稳定15 min，经颈总动脉放血(15 min内)，通过间断放血和自体血回输使平均动脉压(MAP)降至35～45 mmHg，维持90 min。假手术组(sham组)仅麻醉及进行动静脉穿刺，不放血。林格液组(RS组)用3倍最大放血量的林格液复苏，H1、H2组分别用相应的羟乙基淀粉和林格液复苏(各组复苏所用林格液的量为3倍最大的放血量减去相应剂量的羟乙基淀粉)，复苏时间为45 min。

1.4 指标观察 ①记录各组的最大放血量以及休克前(T0)，复苏前(T1)，复苏结束后即刻(T2)，复苏后1(T3)、2(T4)、3(T5)h的MAP(假手术组于相应时间点);② 分别于 T0、T1、T4、T5时间点经颈总动脉采血0.5 ml行血气分析。③ 分别于T5(对照组于相应时间)时间点用动脉放血法处死动物，迅速取相同部位的部分右肺组织固定于2.5%戊二醛磷酸缓冲液中，透射电镜下观察肺组织超微结构变化。④ 分别于T0、T1、T4、T5时间点取动脉血，肝素抗凝，测定外周血白细胞CD11b和CD18的表达。将全血50 μl分别与 0.5 g·L－1FITC 标记的抗 CD11b或抗CD18抗体和0.5 g·L－1FITC标记的小鼠IgGk和IgA1各1 μl室温避光孵育20 min。以溶血素破坏红细胞，用PBS洗涤细胞2次，1 500 r·min－1离心5 min，用流式细胞仪测定各组CD11b和CD18抗体的荧光强度，反映CD11b和CD18的表达水平。

1.5 统计学处理 用SAS 8.0软件进行统计学处理，计量资料用¯±s表示，组间比较用单因素方差分析;组内比较采用重复测量数据的方差分析。

2 结果

2.1 HES130/0.4复苏效果的比较 各液体复苏组最大放血量、放血量占全身总血量的百分比组间差异无统计学意义;各组MAP差异放血前无统计学意义，复苏后各时点MAP组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 HES130/0.4复苏对血气分析结果的影响与sham组比较，各液体复苏组于T1时间点PaO2升高，T1～5PaCO2均降低(P<0.05);与 T0比较，各液体复苏组PaO2于T1时间点、H1组T1～5时间点、H2组T5时间点升高;PaCO2各液体复苏组T1～5时间点降低;除H1组外，各液体复苏组pH于T4、5时间点降低(P<0.05);见Tab 1。

2.3 HES130/0.4复苏对肺组织超微结构的影响Sham组肺血管内皮细胞形态结构正常，气血屏障连续(见Fig 1);RS组肺组织超微结构受损，血管内皮基底膜断裂，气血屏障结构模糊，水肿增厚，Ⅱ型上皮细胞微绒毛明显减少，胞质有空泡，粗面内质网扩张，可见颗粒融合现象，肺泡腔内有红细胞(见Fig 2);H1组除线粒体结构轻微改变外基本接近正常(见Fig 3);H2组Ⅱ型细胞基本正常，核周间隙轻度扩张，粗面内质网轻度扩张，有脱颗粒(见Fig 4)。

2.4 HES130/0.4复苏对大鼠外周血白细胞CD11b和CD18表达水平的影响 与sham组比较，各液体复苏组于T1、T4、T5时间点CD11b和CD18的表达增强(P<0.05);与RS组比较，H1、H2组于T4、T5时间点CD11b和CD18的表达降低(P<0.05);与H1组比较，H2组于T4、T5时间点CD11b和CD18的表达增强(P<0.05);见Tab 2。

Tab 1 Effect of HES130/0.4 resuscitation on blood gas analysis in hemorrhagic shock rats(¯±s，n=6)

Tab 1 Effect of HES130/0.4 resuscitation on blood gas analysis in hemorrhagic shock rats(¯±s，n=6)

*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs RS group;△P<0.05 vs H1 group;☆P<0.05 vs T0

Group PO2/mmHg PCO2/mmHg pH BE/mmol·L －1 Sham T098±10 43.4±2.4 7.414±0.035 －0.7±1.9 T1 100±9 39.6±1.9 7.368±0.029 －0.5±1.4 T4 106±10 42.4±2.5 7.369±0.031 －1.0±1.1 T5 104±9 43.4±1.8 7.401±0.019 －0.9±1.3 RS T0 93±9 41.5±2.0 7.386±0.012 －0.9±1.7 T1 128±8*☆ 33.4±2.2*☆ 7.401±0.025 －4.4±3.0*☆T4 89±8 25.8±3.2*☆ 7.304±0.038*☆ －6.4±2.0*☆T5 85±7 30.9±4.0*☆ 7.295±0.026*☆ －6.9±2.8*☆H1 T0 86±9 42.8±3.3 7.391±0.025 －0.3±1.7 T1 121±10*☆ 32.8±2.3*☆ 7.489±0.028☆ －4.9±2.3*☆T4 108±10#☆ 30.8±1.7*#☆ 7.389±0.037# －6.0±1.3*☆T5 98±9#☆ 31.2±3.3*☆ 7.432±0.025# －3.7±2.0*#☆H2 T0 96±7 43.5±3.0 7.377±0.041 －1.1±1.7 T1 118±8*☆ 32.4±1.8*☆ 7.391±0.030☆ －5.2±3.1*☆T4 102±7# 33.1±1.3*#☆ 7.500±0.040*#△☆ －5.4±2.3*☆T5 87±6△☆ 32.9±2.6*☆ 7.518±0.045*#△☆ －2.3±1.0#

Fig 1 Normal the ultrastructure in sham group(×4 000). Fig 2In Ringer's group typeⅡ cell damaged severely，microvilli decreased obviously，vacuole and cell edema，large amount of erythrocyte and macrophage in alveolar space observed. Fig 3 Mitochondria changed slightly in H1 group. Fig 4 Perinuclear space dilated slightly，rough endoplasmic reticulum expanded slightly，and degranulation observed in H2 group

3 讨论

本研究结果表明，失血性休克复苏大鼠PaO2不同程度降低，且肺组织超微结构出现典型的病理损伤改变，表明肺损伤模型建立成功。由于HES130/0.4具有更大的安全性［1］，每日最大剂量由33 ml·kg－1改为 50 ml·kg－1，甚至有学者应用到 70 ml·g－1［7］，故本研究选用 33、50 ml·kg－1剂量;此外考虑到复苏总量的一致以及晶体和胶体的配合使用，本研究复合不同剂量的林格液加以探讨。由于休克本身造成组织缺氧以及容量复苏后再灌注损伤的发生［8，9］，本研究没有设立模型对照组，而是选用林格液复苏组加以比较。

Tab 2 Effect of HES130/0.4 resuscitation on the expressionsof CD11 and CD18±s，n=6)

Tab 2 Effect of HES130/0.4 resuscitation on the expressionsof CD11 and CD18±s，n=6)

*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs RS group;△P<0.05 vs H1 group

Indicator Group T0 T1 T4 T5 CD11b Sham 30.2±1.5 32.8±2.0 33.8±1.3 30.2±1.6 RS 29.7±1.3 40.7±1.8* 80.8±2.6* 71.9±2.0*H1 30.5±1.4 38.5±1.9*#56.6±2.0*# 43.6±1.9*#H2 32.4±1.5 40.6±1.7*#68.2±1.6*#△ 65.0±1.7*#△CD18 Sham 50.6±1.9 49.6±2.0 51.6±1.8 51.4±2.0 RS 48.8±1.7 62.0±1.9* 92.8±3.5* 88.4±3.9*H1 51.1±2.0 63.2±2.0* 65.3±1.9*# 65.4±2.1*#H2 49.8±1.8 59.6±1.9* 77.9±1.8*#△ 79.4±2.8*#△

实验组给予不同剂量的HES130/0.4后，肺组织氧合功能指标和超微结构有不同程度的改善，说明HES130/0.4可有效抑制失血性休克后早期肺损伤，具有一定的保护作用。

PaO2是反映氧供和氧耗的重要指标之一;失血性休克时，氧供不足，肺组织通过提高氧的摄取和利用，使氧耗增加。本研究中各液体复苏组复苏前PaO2均不同程度增高证实了失血性休克后肺功能的变化。PaO2、PaCO2可在一定程度上反映肺泡毛细血管膜损伤的程度。本研究中与其他两个液体复苏组相比，6%HES130/0.4 33 ml·kg－1复合一定量的林格液复苏后，PaO2、PaCO2、BE恢复较快。

激活的中性粒细胞(PMN)与微血管内皮细胞(MVEC)相互粘附是PMN发挥作用的始动和关键环节［10］。粘附分子介导PMN游走、浸润;整合素家族的MAC-1(CDllb/CD18)是粘附分子之一，在PMN与MVEC的紧密黏附过程中起关键作用。本研究结果表明，与正常对照组比较，失血性休克后林格液复苏可导致大鼠肺组织CD11b和CD18的表达明显增强;用不同剂量的HES130/0.4复苏后CD11b和CD18的表达降低，但这种作用在6%HES130/0.4 33 ml·kg－1复合一定量的林格液复苏时最为明显，表明6%HES130/0.4的抗炎作用与抑制CDllb/CD18这一整合素家族的表达或活性有关，有关研究也支持了这一论点［11，12］;但本研究中 6%HES130/0.4复苏失血性休克早期，随着剂量的增加其抗炎作用并没有相应增强，具体的机制有待于进一步研究。

综上所述，6%HES130/0.4 33 ml·kg－1复合一定量的林格液复苏可减轻失血性休克大鼠早期肺炎性损伤，其机制与抑制CDllb/CD18的表达有关。

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