2型糖尿病大鼠不同组织中p85mRNA及蛋白表达变化与中药干预作用＊

宋菊敏，舒 适，刘小美，宋丽娜

(上海中医药大学基础医学院，上海 201203)

胰岛素抵抗引起2型糖尿病的分子机制非常复杂。某些胰岛素抵抗与胰岛素受体突变有关，然而大多数胰岛素抵抗可能主要由靶组织(肝脏、肌肉、脂肪)的胰岛素受体后信号传导分子的缺陷所引起。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)途径是胰岛素信号传导的主要胞内途径，PI3K是刺激葡萄糖转运和摄取的重要介导分子[1]。PI3K由p85调节亚基和p110催化亚基组成，其中p85调节亚基可能在胰岛素信号传导过程中起到更为重要的作用。复方黄连降糖片在临床上有较好的降血糖作用，为进一步了解其降血糖和治疗糖尿病的可能作用机制，以及p85在胰岛素信号传导中可能起到的作用，我们对此进行了研究。

1 材料与方法

1.1 动物

选用10周龄左右的清洁级健康雌性Wistar大鼠90只，由上海复旦大学医学院实验动物中心提供，体重250g±20g。每笼5只，自由饮水和摄食，光照明暗周期12 h，室温21℃±1℃，湿度50℃±10%。

1.2 药品及其配制

链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)购自美国Sigma公司，临用前以0.1mol/L浓度、pH 4.4柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制成2%浓度STZ溶液。高脂饲料配方由基础饲料55%、猪油16%、蛋黄粉2%、绵白糖27%组成，总热量为19.93kj/g，正常饲料总热量为16.20kj/g。复方黄连降糖片由黄连、大黄、肉桂等中药煎液而成。盐酸二甲双胍片(商品名美迪康，深圳市中联制药有限公司，国药准字H44024853)用蒸馏水配成悬浊液，浓度为51.6mg/ml。

1.3 试剂及仪器

Rt-PCR所用试剂均为美国Fermentas公司产品，p85兔抗大鼠一抗为美国Santa Cruz公司产品，过氧化物酶标记的羊抗兔二抗和DAB试剂盒均为武汉博士德公司产品，PCR9600扩增仪，复日Smart View生物电泳图像分析系统，DYCZ-24D型双垂直电泳槽及DYY-TC型电转移电泳槽。引物序列:p85上游引物5’-GCATCGGAGGCTTATCGG-3’，下游引物5’-GAGGGTTTGGG TGGCAGT-3’，产物长度为332bp;β-Actin上游引物5’-GTGGGGCGCCCC AGGCACCA-3’，下游引物5’-CTTCCTTAA TGTCACGCACGATTTC-3’，产物长度为540bp。

1.4 造模及分组

Wistar大鼠共90只，适应性饲养1周后，其中设正常组15只，其余75只按照28mg/kg体重腹腔注射2%STZ溶液。造模第14天测定空腹血糖和糖负荷2h血糖，以空腹血糖测定结果为准(7mmol/L-10mmol/L)，参考2h血糖随机分为模型组、中药小、中、大剂量组和西药组各13只。分组后，正常组饲以基础饲料，其余各组均给予高脂饲料喂养。

1.5 给药方法

正常组和模型组每日以2.0ml饮用水灌胃，小、中、大剂量组每日均以复方黄连降糖片煎液灌胃，其灌胃浓度分别为0.75ml(0.5g生药/ml)、1.5ml(0.5g生药/ml)、1.5ml(1.0g生药/ml)，分别相当于成人用量的6倍、12倍、24倍;西药组每日以盐酸二甲双胍悬浊液1.0ml(51.6mg/ml)灌胃，相当于成人用量的12倍。用药8周测定空腹血糖、糖负荷2h血糖和空腹血清胰岛素后处死大鼠，取其肝脏、右侧腓肠肌及大网膜脂肪备用。

1.6 测定方法

1.6.1 血糖 采用葡萄糖氧化酶法测定。

1.6.2 血清胰岛素 采用放射免疫双抗体法测定。

1.6.3 p85mRNA表达 按Trizol说明书方法提取各组织总RNA，测定RNA浓度后，取2μgRNA经M-MLV逆转录酶逆转录成cDNA，进行PCR扩增。PCR反应体系为2×PCR mix12.5μl，上、下游引物各1μl(5μmol/L)，反转录产物2μl，DEPC水8.5μl;反应条件为94℃3min;94℃40s，58℃1min，72℃1min，40个循环;72℃5min。PCR反应产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪拍照，Smart View分析凝胶图像，得出目的基因和内参基因的亮度扫描比值。

1.6.4 p85蛋白表达 各组织总蛋白的提取参照《分子克隆实验指南》第3版[2]的蛋白提取方法，应用组织裂解液裂解各组织得到组织总蛋白。取少量用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。从各组织所获蛋白样品经8%SDS-PAGE分离，电转膜致PVDF膜后以5%脱脂奶粉封闭，再分别与1∶200稀释的一抗和1∶2000稀释的二抗反应，再用DAB显色，最后用凝胶成像仪拍照，Smart View分析显色图像得出扫描密度值。

1.7 统计学处理

所有数据均使用SPSS 11.5统计软件进行单因素方差分析，统计结果用平均值±标准差表示。

2 结果

2.1 成模情况

75只大鼠造模后成模65只，另有10只未成模大鼠被剔除。65只成模大鼠被分到模型组，中药小、中、大剂量组和西药组各13只。

2.2 各组大鼠治疗前后空腹血糖和糖负荷2h血糖的变化

表1显示，治疗前与治疗8周模型组与正常组之间空腹血糖均有显著差异(P＜0.01)，治疗前各组空腹血糖与模型组均无显著差异。治疗8周后各治疗组空腹血糖与模型组比较均有显著差异(P＜0.01)。治疗前与治疗8周模型组与正常组之间比较，2h血糖均有显著差异(P＜0.01)。治疗前，各组2h血糖与模型组均无显著差异。治疗8周时，中药中剂量组与模型组比较2h血糖显著下降(P＜0.05)，其他各组均未见显著差异。

表1 各组大鼠治疗前后空腹血糖和糖负荷2h血糖变化表

表1 各组大鼠治疗前后空腹血糖和糖负荷2h血糖变化表

注:与正常组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01;与模型组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 n 治疗前空腹(mmol/L)治疗后空腹(mmol/L)治疗前2h(mmol/L)治疗后2h(mmol/L)正 常 组15 5.84±1.56 5.84±0.48 6.04±0.63 6.14±0.50模 型 组 13 7.76±2.64△△ 8.58±2.17△△ 11.17±6.13△△ 10.13±4.29△△小 剂 量 组 13 7.35±1.47 6.62±1.29＊＊ 11.37±4.50 9.01±2.29中 剂 量 组 13 7.36±1.38 6.85±0.71＊＊ 10.71±2.84 7.89±0.71*大 剂 量 组 13 7.30±1.24 6.73±0.62＊＊ 10.70±3.93 10.54±4.23西 药 组 13 7.27±1.74 6.14±0.88＊＊10.49±3.77 8.62±1.94

2.3 各组大鼠血清胰岛素的变化

表2显示，模型组和正常组比较，大鼠血清胰岛素显著升高(P＜0.05);各用药组与模型组相比，中药大剂量组和西药组血清胰岛素浓度显著降低(P＜0.05)，其他各组仅有降低趋势，但没有显著差异。

表2 各组大鼠血清胰岛素变化表

表2 各组大鼠血清胰岛素变化表

注:与正常组比较:△P＜0.05;与模型组比较:*P＜0.05

组别n血清胰岛素(μU/ml)正 常 组15 38.13±21.93模 型 组 13 58.66±25.09△小 剂 量 组 13 43.81±28.07中 剂 量 组 13 39.79±15.83大 剂 量 组 13 34.57±25.21*西 药 组 13 34.21±23.38*

2.4 各组大鼠肝脏p85mRNA及蛋白表达变化

表3图1显示，各组大鼠肝脏p85mRNA表达的变化与正常组比较，模型组p85mRNA的表达显著减少(P＜0.01);各用药组与模型组比较，各组的p85mRNA表达均较模型组显著升高(P＜0.05)。

图1 大鼠肝脏p85mRNA表达电泳图

表3 各组大鼠肝脏p85基因表达变化表

表3 各组大鼠肝脏p85基因表达变化表

注:与正常组比较:△△P＜0.01;与模型组比较:*P＜0.05

组别 n mRNA表达(目的/内参比值)蛋白表达(密度)正 常 组60.53±0.08 1.59±0.19模 型 组 6 0.30±0.04△△ 1.13±0.14△△小 剂 量 组 6 0.45±0.16* 1.31±0.15中 剂 量 组 6 0.44±0.10* 1.33±0.15*大 剂 量 组 6 0.46±0.15* 1.33±0.16*西 药 组 6 0.47±0.13* 1.34±0.20*

表3图2显示，各组大鼠肝脏p85蛋白表达的变化与正常组比较，模型组p85蛋白表达显著减少(P＜0.01);与模型组比较，中剂量组、大剂量组和西药组p85蛋白表达显著升高(P＜0.05)，小剂量组虽有升高趋势，但无统计学意义。

2.5 各组大鼠骨骼肌p85mRNA及蛋白表达变化

图2 大鼠肝脏p85蛋白表达电泳图

表4图3显示，各组大鼠骨骼肌p85mRNA表达的变化:与正常组比较，模型组p85mRNA的表达显著减少(P＜0.01);各用药组与模型组比较，中剂量组和西药组的p85mRNA表达较模型组显著升高(P＜0.01，P＜0.05)，另外2中药组有升高趋势，但无统计学意义。

表4 各组大鼠骨骼肌p85基因表达变化表

表4 各组大鼠骨骼肌p85基因表达变化表

注:与正常组比较:△△P＜0.01;与模型组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 n mRNA表达(目的/内参比值)蛋白表达(密度)正 常 组60.86±0.21 1.33±0.12模 型 组 6 0.35±0.07△△ 0.94±0.14△△小 剂 量 组 6 0.44±0.18 1.14±0.17*中 剂 量 组 6 0.69±0.25＊＊ 1.22±0.16＊＊大 剂 量 组 6 0.58±0.26 1.18±0.15＊＊西 药 组 6 0.63±0.11* 1.19±0.15＊＊

图3 大鼠骨骼肌p85mRNA表达电泳图

图4 大鼠骨骼肌p85蛋白表达电泳图

表4图4显示，各组大鼠骨骼肌p85蛋白表达的变化:与正常组比较，模型组p85蛋白表达显著减少(P＜0.01);与模型组比较，小剂量组p85蛋白表达显著升高(P＜0.05)，中剂量组、大剂量组和西药组升高更为显著(P＜0.01)。

2.6 各组大鼠脂肪p85mRNA及蛋白表达变化

表5图5显示，各组大鼠脂肪p85mRNA表达的变化:与正常组比较，模型组p85mRNA的表达显著减少(P＜0.001);与模型组比较，中剂量组和西药组的p85mRNA表达显著升高(P＜0.05)，另外2组有升高趋势，但无统计学意义。

图5 大鼠脂肪p85mRNA表达电泳图

图6 大鼠脂肪p85蛋白表达电泳图

表5 各组大鼠脂肪p85基因表达变化表

表5 各组大鼠脂肪p85基因表达变化表

注:与正常组比较:△△P＜0.01;与模型组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 n mRNA表达(目的/内参比值) 蛋白表达(密度)正 常 组60.80±0.16 1.50±0.03模 型 组 6 0.50±0.07△△ 1.16±0.07△△小 剂 量 组 6 0.58±0.14 1.25±0.16中 剂 量 组 6 0.66±0.10* 1.33±0.06*大 剂 量 组 6 0.58±0.07 1.38±0.06＊＊西 药 组 6 0.65±0.08* 1.41±0.11＊＊

表5图6显示，各组大鼠脂肪p85蛋白表达的变化:与正常组比较，模型组p85蛋白表达显著减少(P＜0.001);与模型组比较，中剂量组、大剂量组和西药组p85蛋白表达显著升高(P＜0.05，P＜0.01)，小剂量组有升高趋势，但无统计学意义。

3 讨论

PI3K由含SH2区的p85调节亚基和具有酶活性的p110催化亚基组成。在胰岛素的刺激下，胰岛素受体与胰岛素受体底物(insulin receptor substrate，IRS)结合并使其活化，随后p85亚基通过SH2结构域与IRS相结合，当2个SH2结构均被磷酸化后，p110的活性达到最大。P110被激活后，催化一系列磷酸肌醇磷酸化，从膜磷脂中产生磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸，后者作为胰岛素的第二信使，与含有PH区段的下游分子结合将信号下传，调节肌细胞、脂肪细胞和肝细胞对葡萄糖的摄取以及糖原合成、抗脂肪分解等其他多种生物学效应[3]。

复方黄连降糖片是上海名老中医的经验方，由黄连、大黄、肉桂组成，以清热泻火为主，兼有活血化瘀之功效，加肉桂能制黄连和大黄之苦寒，防止苦寒伤阴，又能引火归元，使阴平阳秘，达到阴阳平衡。三药配伍，使火热得清，津液得存，又无苦寒伤阴之弊。我们以往的实验已证实，其对糖尿病动物模型有良好的降糖、调脂作用，并能降低血清胰岛素水平，升高KK小鼠肝脏、脂肪细胞InsRmRNA的表达以及脂肪、骨骼肌细胞GLUT4mRNA的表达[4、5]。为更进一步了解其降糖、改善胰岛素抵抗的分子机制，我们对2型糖尿病大鼠不同组织中p85基因表达的变化进行了研究。

本次实验中，模型大鼠出现高血糖、高胰岛素血症等典型2型糖尿病胰岛素抵抗症状，提示我们用小剂量STZ合并高脂饮食造模是成功的。此外，实验动物不同组织的p85亚基，无论是其mRNA或是蛋白，在2型糖尿病模型中的表达均显著较正常对照组减少。p85作为PI3K的主要组成部分及p110与IRS间的桥梁，其表达缺陷可能造成胰岛素信号传导PI3K途径的障碍，使胰岛素的信号在细胞内的传递减少或者减慢，最终引起高血糖和高胰岛素血症等糖尿病胰岛素抵抗症状。在用复方黄连降糖片等药物干预治疗后，在糖尿病症状显著改善的同时，2型糖尿病模型大鼠肝脏、骨骼肌与脂肪组织中的p85亚基的表达均有显著提高，其中以蛋白表达的改善更为显著，同时3个组织当中又以骨骼肌p85基因的表达提高最为显著。以上结果提示，该复方对2型糖尿病胰岛素抵抗的治疗作用可能与它们能提高不同组织中p85基因的表达而改善胰岛素的信号传导有关。

[1]金 丹，陆付耳.PI3-K在2型糖尿病发病机制中的作用[J].医学综述，2007，13(1):21-23.

[2]J萨姆布鲁克，E F弗里奇，T曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南[M].金冬雁，黎孟枫，张 励，等译.第2版.北京:科学出版社，1993.881-887.

[3]杨亚超，周玉萍，王颜刚.胰岛素抵抗的信号传导障碍[J].中国临床康复，2004，8(30):6747-6749.

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[5]宋菊敏，刘小美，孔祥亮，等.复方黄连降糖片(糖尿宁)治疗2型糖尿病阐析[J].上海中医药杂志，2008，42(5):24-25.