利用LC/MS/MS方法检测附子水提液中乌头碱的含量方法学研究＊

马 芳，赵 东，吴晓霞，闫 寒，范 斌，窦德强，彭 娟，聂颖兰，郭 娜，于友华△

(1.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大 连 116620;2.中国中医科学院医学实验中心，北京 100700)

附子为毛莨科草本植物乌头 Aconitum carmichaeli Debx.子根的加工品，其加工品又可分为盐附子、黑附片(黑顺片)、白附片、淡附片、炮附片。始载于《神农本草经》，辛、甘，大热、有毒，归心、肾、脾经，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛之功效。现代药理研究表明，附子有强心、增加血管血流量、升血压、抗炎、促进免疫等作用[1～5]，在临床也有广泛的应用。由于附子中双酯型生物碱类成分的治疗剂量和中毒剂量非常接近[6～7]，所以检测附子水提液中这类生物碱的含量非常重要，有关附子中双酯型生物碱含量测定的报道比较多[8～10]，但这些方法均采用的是HPLC法测定。众所周知，附子中双酯类生物碱是其含量限定的成分，固含量较低，利用HPLC方法检测所需药材较多且用时较长。本文建立的检测附子水提液中乌头碱的LC/MS/MS方法，在8min内出峰，方法快速灵敏。

1 材料

1.1 药物及试剂

乌头碱(A0196)购于微科生物科技有限公司，白附片产地四川，批号0090414，由中国中医科学院中药研究所何希荣主管药师鉴定为毛莨科多年生草本植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.的子根的加工品。无水乙醇(分析纯)、乙腈(色谱纯)、甲酸(色谱纯)均购于北京迪科马科技有限公司。

1.2 仪器

Agilent 6410 QQQ LC-MS分析系统(美国Agilent RRLC液相色谱仪;Agilent 6410 QQQ三重四级杆质谱检测器;Masshunter工作站)，赛多利斯ariumR61316/611VF超纯水处理器，赛多利斯BT25S分析天平，多功能提取罐。

2 附子水提液含量测定方法学考察及含量测定

2.1 色谱条件

液相条件:Agilent ZORBAX C18SB(2.1×100mm 1.8-Micron);流动相:A.水(0.05%FA)，B.乙腈，A∶B=72∶28(V/V)，梯度洗脱:0min～2min，B.28%～34%;2min～6min，B.34%～35%;6min～10min，B.35%～100%;流速为0.35mL·min－1;柱温:40℃。

质谱条件:正离子模式，MRM，乌头碱m/z 646.4→586.4，利用以上色谱条件分析得到乌头碱对照品的总离子流图(TIC)(图1)及其在附子水提液中的TIC图(图2)。

图1 对照品乌头碱的TIC图

图2 附子水提液中乌头碱的TIC图

2.2 附子水提液的制备

白附片1kg加入10L水浸泡12h后，回流提取3次，每次2h，合并水提液，减压浓缩，最后得生药量为1g·mL－1的附子水提液。

2.3 供试品溶液的制备

精取附子水提液，稀释100倍后取1mL，精密加入8倍量无水乙醇涡旋，在4℃下静置24h抽滤，定容至100mL容量瓶中，超声混匀、滤过，待测。

2.4 线性关系

精密称取乌头碱对照品，配制0.011、0.023、0.045、0.09、0.180、0.360、0.720ng·mL－1一系列浓度的对照品溶液，按2.1的色谱条件进样分析。以峰面积Y对浓度X进行回归处理得到乌头碱的回归方程Y=3804.200X－73.576(r=0.9978)。

2.5 精密度试验

按2.3制得的样品连续进样6次，记录各组分的峰面积，计算6次的标准偏差(RSD)，得到日内精密度，按2.3制得的同一样品连续进样6 d，记录各组分的峰面积，得到日间精密度，结果见表1。

2.6 重复性试验

表1显示，按2.3平行制备6份样品，按2.1的色谱条件进样分析，记录各组分的峰面积。

2.7 加样回收率试验

表1显示，采用加样回收法，取样品适量加入乌头碱适量，按上述条件测定。

表1 精密度、重复性及加样回收率考察

2.8 样品稳定性

将制备好的供试品溶液于0、2、4、6、8、10、12、24h进样分析，考察供试品溶液当天的稳定性，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.9 附子水提液的含量测定

对附子水提液按2.3项下制备，测得浓度为0.185 ng·mL－1。

3 讨论

本方法利用LC/MS/MS方法对附子水提取液中乌头碱进行了含量测定，比传统方法快速、准确且灵敏。

[1]陈长勋，金若敏.用血清药理学实验方法观察附子的强心作用[J].中国中医药科技，1996，3(3):12-14.

[2]马宗超，唐智宏，张 海.谈附子的药理及临床应用[J].时珍国医国药，2004，15(11):790.

[3]韩 涛.附子汤对心血管药理的作用研究[J].山东中医学院学报，1992，16(5):33-36.

[4]王胜林，董耀荣.附子水煎液对心梗后心力衰竭大鼠血流动力学的影响[J].陕西中医，2007，28(6):745-748.

[5]张俊平，杨卫平.附子对慢性充血性心力衰竭模型大鼠NO、TNF-α水平的影响[J].浙江中医药大学学报，2009，33(1):38-42.

[6]杨世雷.附子的毒性及应用[J].中国现代药物应用，2009，3(3):76-77.

[7]张为亮，徐楚江.附子毒效关系的实验研究[J].广西中医药，1997，20(3):43-44.

[8]魏玉辉，王晓华，沈明谦，等.藤药中乌头碱含量测定HPLC方法的建立[J].中成药，2008，30(1):130-131.

[9]刘玉兰，刘世坤，裴 奇，等.高效液相色谱法测定附子中3组分的含量[J].中国药房，2006，17(16):1255-1256.

[10]王 瑞，孙毅坤，王 耘，等.高效液相色谱法测定附子及其炮制品中三种双酯型生物碱[J].现代生物医学进展，2007，7(7):1078-1080.