抗花叶病转基因甘蔗安全性评价

张 铃，杨川毓 ，郭 莺，阮妙鸿，林新期，陈如凯，张木清

（1.福建农林大学甘蔗研究所，福州 350002；2.福建省亚热带植物研究所，厦门 361002；3.福建省农业厅，福州 350003）

甘蔗花叶病是一种由病毒侵染引起的世界性甘蔗病害，主要破坏甘蔗叶片的叶绿体，严重制约其光合作用，从而使甘蔗的生长受到限制，糖分减少，产量下降。研究发现当花叶病病毒侵染率达到75%时，产量降低5%～19%[1]。选育和利用抗病品种是控制甘蔗花叶病的根本措施，但由于甘蔗是异源多倍体，遗传背景复杂，常规条件下难以开花。因此传统甘蔗抗病育种手段不仅周期长且效率低。Powel-Abel（1986）[2]最先报道了将TMV-CP基因导入烟草中获得对TMV（烟草花叶病毒）具有抗性的转CP基因烟草，为甘蔗抗花叶病基因工程育种提供了新的思路。澳大利亚Smith等（1996）[3-5]采用基因枪将甘蔗花叶病毒外壳蛋白（ScMV-CP）基因转化到甘蔗的茎分生组织获得了嵌合型的转化植株，检测表明外源基因已整合到甘蔗基因组中。Ivan L.Ingelbrecht（1999）等[6]以CP65-357和CP72-1210为受体，利用基因枪轰击将高粱花叶病毒基因转入甘蔗体内。本实验室（2003；2007）通过基因枪分别将ScMV-CP基因与SrMV-P1基因转入甘蔗品种拔地拉（Badila）与福农95-1702中，经分子鉴定，目的基因已整合到甘蔗基因组中，且抗病鉴定结果表明转基因甘蔗对甘蔗花叶病抗病能力明显提高[7-8]；后对其3年的田间发病率调查显示转基因甘蔗的发病率均低于5%。

目前有关获得甘蔗抗花叶病转基因甘蔗的报道不断增多，与其他转基因植物一样，其生物安全性的问题也引起了许多争论。近年，陆续出现了许多有关转基因植物生物安全的报道，但有关抗花叶病转基因甘蔗的研究报道却十分少见。抗花叶病转基因甘蔗与其他转基因材料有许多共同点，也存在许多不同点。因此，本文拟从抗花叶病转基因甘蔗的食品安全、土壤生态安全、基因漂移、病毒的异源包装与重组以及杂草化等方面进行逐一论述。

1 抗花叶病转基因甘蔗的食品安全

抗花叶病转基因甘蔗的外源基因是来源于甘蔗花叶病毒本身。有研究表明：甘蔗花叶病毒的热钝化温度为53～55℃[9]。热钝化温度是指使病毒丧失侵染力的最低温度。作为蔗糖和酒精生产主要工业原料的甘蔗，其加工过程都需要经过高温炼煮。因此，在甘蔗的加工过程中，其体内的核苷酸与蛋白都已经失活，对最后产生的产品蔗糖和酒精可能不造成影响。但对于在加工过程中抗花叶病转基因甘蔗的内源毒素降解是否会对其重要的营养素造成影响，还有待进一步研究和观察。

甘蔗除加工制糖、生产酒精外，也可以作为果蔗直接食用。抗花叶病转基因甘蔗所插入的相关病毒基因和标记基因以及抗生素的抗性基因等是否会对人的身体健康有所影响引起人们的很大关注。目前许多研究表明：在转基因植物中病毒蛋白的表达，并不会给人类带来不良的反应，尤其值得注意的被病毒侵染的植物仍然作为食品被人们所消费，但还没有见到其给人类带来不良影响[10]。而目前抗花叶病转基因甘蔗中常用的筛选标记基因是npt II。Fuchs等（1993）[11]对nptⅡ基因进行过严格的安全性评价，结果表明nptⅡ蛋白不会带来安全问题。近年来，一些安全性标记基因（如pmi基因）在转基因甘蔗上得到使用，也在一定程度上提高抗花叶病转基因甘蔗的食品安全性[12]。抗花叶病转基因甘蔗中所用到的标记基因中包括抗生素抗性基因。目前学者普遍认为标记基因是安全的，但是抗生素的抗性基因可能会转移到人体的肠道微生物或者上皮细胞中，从而对人体产生不利影响或者降低抗生素在临床治疗中的有效性。FDA（1994）对卡那霉素抗性基因Kanr的研究表明：抗生素的抗性基因不会引起安全性问题[13]，而且目前也没有报道指出抗生素的抗性基因对人体有毒害作用。但是，抗花叶病转基因甘蔗的食品安全性研究不能局限于此，仍要通过受体植物与供体生物历史背景的分析、营养成分的评价、生物信息学分析、分子生物学技术、毒理学评价、致敏性评价等方面进行多层次、多角度的探讨[14]。

2 抗花叶病转基因甘蔗对土壤生态环境的影响

土壤是生态系统中物质和能量转化的主要场所，并且作为植物生长的媒介，其生态功能不容忽视。因此，土壤中物质代谢，主要微生物种群变化以及生物多样性的稳定性，是保证土壤生态功能正常、稳定的前提基础[15]。转基因甘蔗与其亲本在遗传性状、生理代谢、以及相关基因的表达产物上存在一定的差异，外源基因可能通过根系分泌物进入到土壤生态环境中，从而产生一些不可预测的影响。

2.1 对土壤物质代谢的影响

氮、碳、磷代谢是土壤物质代谢中的三大代谢，与其相关的脲酶、蔗糖酶、磷酸单脂酶等酶活性发生异样，可能导致氮、碳、磷三大代谢发生混乱，从而一定程度上影响土壤对有机质的分解、土壤生物的生态过程以及土壤结构和肥力水平[16]。转基因甘蔗由于其外源基因导入，可能会对土壤物质代谢造成一定的影响。阮妙鸿等研究表明：转ScMV-CP基因甘蔗显著（p＜0.05）降低了土壤脱氢酶的活性，提高了土壤的纤维素酶、蛋白酶和脲酶活性（p＜0.01），而对蔗糖酶和磷酸单脂酶没有影响[17]。付云霞（2007）对转SrMV-P1基因甘蔗在不同栽培方式，不同生育期进行研究表明：转SrMV-P1基因甘蔗对根际土壤脲酶和酸性磷酸酶的活性影响很小，而对蔗糖酶、碱性磷酸酶和过氧化氢酶的活性皆有一定的影响[18]。郑碧霞（2008）在付云霞的基础上，对转SrMV-P1基因甘蔗进行跟踪研究表明：转SrMV-P1基因甘蔗对根际土壤脲酶、蔗糖酶、碱性磷酸酶活性相比受体材料差异不显著，而对酸性磷酸酶有一定的影响[19]。

综上所述，导入不同的外源基因，可能使抗花叶病转基因甘蔗对土壤代谢造成不同的影响。但由于影响土壤酶活性的因素众多，所以不同的试验，所受到的影响因素不同，可能得到不同的结果。且土壤酶活性的差别也可能是由植物生理特性的不同所引起。因此，目前有关抗花叶病转基因甘蔗是否会给土壤中与氮、碳、磷相关代谢的酶造成影响，从而破坏土壤中正常的物质及能量转化，还有待进一步研究。

2.2 对土壤微生物种群的影响

抗花叶病转基因甘蔗进入土壤后，土壤中的微生物利用植物根际分泌物进行自身的生长繁殖，它们之间相互作用且相互影响。主要体现在：土壤微生物分解土壤有机质和促进腐殖质形成；吸收和固定并释放养分，对植物营养状况的改善和调节有主要作用；与植物共生、促进植物生长等[20]。另外，土壤微生物特性对土壤基质的变化敏感，其群落结构组成等可以反映土壤肥力状况。因此，近年来把土壤微生物群落结构的组成作为评价土壤健康的主要指标[15]。

阮妙鸿等通过盆栽、田间种植及人工残体掩埋，利用BIOLOG Ecoplate TM微平板（BIOLOG Inc.，USA）结合微生物的平板培养及相关的土壤酶活性分析，研究了转ScMV-CP基因甘蔗对根际土壤微生物的影响。研究发现，转基因甘蔗对土壤微生物数量和均匀度有一定影响，但对活性和多样性的影响不明显[21]。而付云霞（2007）通过对转SrMV-P1基因甘蔗不同生育期根际土壤微生物的研究表明，转SrMV-P1基因甘蔗对根际土壤放线菌和真菌的影响较为复杂，但对根际细菌的影响很小[18]。郑碧霞（2008）通过跟踪研究表明：转SrMV-P1基因甘蔗对根际土壤细菌和放线菌存在显著差异，但对真菌数量差异不明显[19]。因此，有人认为可能是由于外源基因蛋白在土壤根际的表达，引起土壤微生物种群的变化[22]。也有人认为，转基因作物对土壤特定微生物产生的显著影响可能是由转基因植株的形态学上以及其生理生化特性的改变而引起[22]。但也有一些报道发现转基因作物对土壤生物不会带来影响[23]。迄今为止的研究结果可以看出，抗花叶病转基因甘蔗对土壤生物群落的影响比较复杂且无规律可循，不同遗传背景的转基因甘蔗生长环境不一样，皆可能对土壤微生物造成迥异的影响。因此，抗花叶病转基因甘蔗对土壤微生物种群影响的研究应该进行长年的追踪研究及更深入的探讨。

3 抗花叶病转基因甘蔗基因漂移的研究

所谓基因漂移，是指一种生物的目标基因向附近野生近缘种的自发转移，导致附近野生近缘种发生内在的基因变化，具有目标基因的一些优势特征，形成新的物种，以致整个生态环境发生结构性的变化。花粉传播是转基因植物的外源基因发生漂移的主要途径[24]。甘蔗作为一种无性繁殖作物，通常情况下不易开花，因此，很少存在由于花粉引起的外源基因漂移。但是，外源基因还可以通过重组、复制、转导、转化和转位等途径在微生物之间相互转移，在植物与微生物之间也会自然发生[25]。Hofmaan等[26]证实了转基因植物中的外源基因也会水平转移到其它微生物中，转基因油菜、黑芥菜、蒺藜和甜豌豆中抗生素基因可通过转基因植株的根系分泌物转移到一种能与植物共生的黑曲霉微生物中。因此转基因植物也存由于基因的水平转移所带来的风险。

但是，也有学者认为：外源基因水平转移的可能性是十分小的，理由为：①DNA从植物细胞中释放出来后，很快被降解成小片段，因此植物DNA进入有肠道微生物存在的小肠下段、盲肠和结肠前已被降解。②即使有完整的DNA存在，DNA转移整合进入受体细胞并进行表达也是一个非常复杂的过程。目前尚未发现消化系统中有外源基因转移至肠道微生物的现象。Nielsen等[27]对种植转nptⅡ基因的甜菜的土壤进行测定，发现在灭过菌的土壤中发生转化的几率为1.4×10-8，而在未灭菌的土壤中未检测到有转化菌株。对种植转nptⅡ基因甜菜的土壤进行测定，并未发现含有或表达该基因的土壤微生物[28]。周琴等[29]研究也没有发现转基因作物中的Bt cry1 Ac10基因向土壤中的细菌、真菌和放线菌转移。因此，在土壤中，基因的水平转移即使发生，其频率亦应很低。另外需要指出的是，自然土壤生态系统中微生物丰富多样，具有强大的缓冲能力，因而人工引入或外来的微生物很难与其竞争；这一事实使得许多土壤微生物学家对转基因植物的基因水平转移问题备感乐观；但今后随着新的外源基因的不断引入和广泛使用，其所产生的基因流动问题仍需高度关注[30]。

4 抗花叶病转基因甘蔗病毒的异源包装和重组

目前对于转抗病毒作物是否会导致新型病原体的产生，主要有两方面的安全担忧：一是病毒的异源包装或称转移包装；二是病毒的异源重组。

4.1 病毒的异源包装

病毒异源包装是病毒的基因组被其他病毒的外壳蛋白所包裹，这种现象通常是在植株受多种病毒侵染时发生。例如，病毒的异源包装也可能是已经转了其他相关的病毒基因的甘蔗，又转入了CP基因，病毒的基因被CP的外壳蛋白包裹而引起病毒特性的改变。因为CP基因在众多的因素中对致病性与载体的特异性具有决定性，而使得原先转入其他相关病毒基因的甘蔗特性有可能发生改变[10]。这可能会给转基因甘蔗带来严重的危害。目前关于转基因植物中出现病毒的异源包装已有很多报道[31-33]。

4.2 病毒的异源重组

重组是两种不同的DNA分子在复制过程中遗传物质的交换。重组也可能发生在抗花叶病转基因甘蔗中病毒基因与活性病毒基因的复制过程中。重组后的病毒可能包括转抗病毒基因甘蔗中的抗生素基因和活性病毒基因组片段。因为重组改变了活性病毒的基因组，同时也改变了病毒的相关性质。这些经过重组后的病毒可能会给生态环境带来一些负面影响。例如转播媒介的改变、宿主范围的扩大、以及致病性的增强等等。已有许多研究报道了在转基因植物中出现了病毒的重组[34-39]。

目前，绝大多数抗花叶病转基因甘蔗都是通过导入CP基因以及甘蔗花叶病毒上的相关基因，来提高其抗病性。在提高甘蔗抗病性的同时，也要重视抗花叶病转基因甘蔗所带来的一些负面影响。而有关抗花叶病转基因甘蔗上的病毒的异源包装和重组研究少之又少，因此，对这方面的研究应该引起足够的重视。

5 转抗甘蔗花叶病基因甘蔗杂草化的研究

由于杂草难以防除，且对农业生产造成重大经济损失，所以转基因作物是否会杂草化是评价转基因环境安全的一个重要指标。通过基因工程手段插入外源基因，从而使作物可能具有更强的生存竞争能力。并且有些作物（例如甘蔗）本身就具有杂草性，若将它们作为受体材料，可能增加其演变成杂草的概率。但由于甘蔗是经过人类长期的驯化培育而成，已基本丧失了杂草的遗传特性，仅靠一两个外源基因就使得他们转变成杂草的可能性非常的小[40]，即使抗花叶病转基因甘蔗在抗花叶病方面比亲本具有较大的优势，但一旦当它离开了特定的选择压力后，其竞争优势也会立即丧失。并且从目前水稻、玉米、棉花、大豆等转基因植物的田间调查来看，转基因植物的生存竞争能力并不比非转基因植物强，也没有演变成农田杂草。

但也有一些例子表明转基因植物可能转变成杂草。加拿大转基因油菜在麦田中变成了杂草[41]，且难以治理。而黑麦草、牛筋草、小白酒草、多花黑麦草、香丝草、车前子6种杂草表现出了对草甘膦的抗性，也是由Roundup Ready类转基因作物引起的[42]，说明转基因作物基因漂移到杂草上，导致杂草抗性的产生。

因此通过一些手段来预防转基因作物的杂草化是必要的。主要通过隔离手段和生物手段，前者是制造空间和时间上的距离来防范，后者通过使种子不育、雄性不育、叶绿体母系遗传、闭花受精和无融合生殖等遗传学手段来控制[43]。

6 小结与展望

随着现代生物技术的兴起，转基因技术为培育抗花叶病甘蔗育种提供了一条便捷、高效的途径。同时，也在一定程度上提高了甘蔗的产量和糖分，推动了我国糖料事业的发展。但是，抗花叶病转基因甘蔗与其他转基因植物一样，可能会带来一定的生态风险。目前，我国虽然对抗花叶病转基因甘蔗生态安全有一定的研究，但还存在着许多不足。一些问题还具有一定争议，一些试验设计，数据处理方法仍存在缺陷，不能确切地评估抗花叶病转基因甘蔗的生态风险。在食品安全性的问题方面，只是根据国外的研究进行推测，目前还没有确切的研究结论。而在土壤生态安全方面，由于土壤的复杂性，目前得出的结论仍然不具有很强的说服力。在对基因漂移和对病毒异源包装和重组的研究，还属于空白。这些问题说明目前在对抗花叶病转基因甘蔗的研究还存在许多问题。

由于生态风险是一个主要而又复杂的问题，目前对于抗花叶病转基因甘蔗以及转基因植物而言，还没有一个完善的安全评价体系。笔者希望从以下几个方面进一步改良目前的评价体系：（1）由于甘蔗是一年生作物，对抗花叶病转基因甘蔗生态风险评价需要长年定点定植，收集多年的数据，观察多年生态变化，才能得出确切的结果；（2）使用合理的试验设计，减少其他制约试验的因素，尤其是对土壤生态环境研究方面。因为影响土壤因素太多，往往得出的结果不够准确；（3）将数学建模的思想引入抗花叶病转基因甘蔗生态安全的研究中。也许能够更合理对其生态安全进行评价，而且该思想已经在其他方面环境评价中得到应用。

总之，对抗花叶病转基因甘蔗安全性评价应该从多层次、多角度进行研究，然后建立科学的生物安全评价指标体系。

[1]陈宇航，周仲驹，林奇英.甘蔗花叶病毒株系的研究[J].福建农学院学报，1988，17（1）：44-48.

[2]Powel-Abel.Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene[J].Science，1986，232（4751）：738-743.

[3]Smith G R，Ford R，Frenkel M J，et al.Transient expression of the coat protein of sugarcane mosaic virus in sugarcane protoplasts and expression in Escherichia coli[J].Archives of Virology，1992，125（1-4）：15-23.

[4]JoycePA，McQualterRB，BernardMJ，etal.EngineeringforresistancetoSCMVinsugarcane[J].ActaHorticulture，1998，461：385-391.

[5]Smith GR，Gambley RZ，Egan B T，et al.Progress in development of a sugarcane meristem transformation system and production of SCMV-resistant transgenics[J].Proceedings of the Australian Society of Sugar Cane Technologists，1994，15（6）：237-243.

[6]Ivan L.Ingelbrecht，James E.Irvine，et al.Posttranscriptional Gene Silencing in Transgenic Sugarcane.Dissection of Homology-Dependent Virus Resistance in a Monocot That Has a Complex Polyploid Genome[J].Plant Physiol，1999，119（4）：1187-1198.

[7]姚伟，余爱丽，徐景升，等.转ScMV-CP基因甘蔗的分子生物学分析与鉴定[J].分子植物育种，2004，2（1）：13-18.

[8]郭莺.我国四个蔗区甘蔗花叶病毒分子鉴定及其蛋白基因的分析[D].福州：福建农林大学，2008.

[9]王水琦，叶小丽，陈庭俊.甘蔗花叶病毒病的研究进展[J].中国农学通报，2002，18（4）：94-97.

[10]Marc Fuchs，Dennis Gonsalves.Safety of Virus-Resistant Transgenic Plants Two Decades After Their Introduction：Lessons from Realistic Field Risk Assessment Studies Annu[J].Rev.Phytopathol，2007，45：173-202.

[11]Fuchs R L，Ream J E，Hammond.Safety assessment of the Neomycin Phospho transferase Ⅱ （NPTⅡ） protein[J].Bio Technol，1993，11：1543-1547.

[12]卓晓蕾.甘蔗遗传转化中的pmi筛选标记及其安全性评价[D].福州：福建农林大学，2007.

[13]杨丽琛，杨晓光.转基因食品中标记基因的生物安全性研究进展及对策[J].卫生研究，2003，32（3）：239-245.

[14]付仲文，连庆，李宁.转基因植物食用安全性评价现状[J].农业科技管理，2009，28（6）：24-37.

[15]Angle J S.Release of transgenic plants：biodiversity and population-level considerations[J].Col Ecol，1994，3（1）：45-50.

[16]Bruinsma，M.，G.A.Kowalchuk，J.A.van Veen.Effects of genetically modified plants on microbial communities and processes in soil[J].Biol.Fertil.Soils，2003，37（6）：329-337.

[17]阮妙鸿，许燕，郑瑶，等.转ScMV-CP基因甘蔗对根际土壤酶活性及微生物的影响[J].中国农学通报，2007，23（4）：374-377.

[18]付云霞.转SrMV-P1基因甘蔗土壤生态安全评价[D].福州：福建农林大学，2008.

[19]郑碧霞.转SrMV-P1基因甘蔗遗传稳定性评价及抗病生理机制研究[D].福州：福建农林大学，2009.

[20]TREVORS J T，KUIKMAN P，WATSON B.Transgenic plants and biogeochemical cycles[J].Molecular Ecology，1994，3（1）：57-64.

[21]阮妙鸿，许燕，郑瑶，等.转ScMV-CP基因甘蔗对土壤微生物的影响[J].热带作物学报，2008，29（2）：187-191.

[22]邵宏波，梁宗锁，邵明安.转基因生物体对生态环境的影响及其发展趋向[J].农业工程学报，2005，21（增刊）：195-200.

[23]Donegan，K.K.，D.L.Schaller，et al.Microbial populations，fungal species diversity and plant pathogen levels in field plots of potato plants expressing the Bacillus thuringiensis var.tenebrionis endotoxin[J].Transgen，1996，5（1）：25-35.

[24]陈兴玲，胡建军，赵楠木.转基因植物基因漂移研究[J].安徽农业科学，2007，35（10）：2851-2852，2867.

[25]王忠华，叶庆富，舒庆尧，等.转基因植物根系分泌物对土壤微生态的影响[J].应用生态学报，2002，13（3）：373-375.

[26]Hoffmann T，Golz C and Schieder O.Foreign DNA sequences are received by a wild-type strain of A niger after co-culture with transgenic higher plants[J].Curr Genet，1994，27（1）：70-76.

[27]Nielsen，KM.，JD.Van Elsas，K Smalla.Transformation of Acinetobacter sp.Strain BD413 （pFG4nptII） with transgenic plant DNA in soil microcosms and effects of kanamycin on selection of transformants[J].Appl Environ Microbiol，2000，66（3）：1237-1242.

[28]吴迪，王秋玉.转基因植物对根际土壤生态系统的影响[J].中国生物工程杂志，2007，27（2）：113-118.

[29]周琴，孙明，李林，等.苏云菌芽胞杆菌标记重组菌株的构建与杀虫基因水平转移[J].应用生态学报，2005，16（1）：142-146.

[30]唐影，李世东，缪作清.转基因作物对对土壤微生物的影响[J].中国生物防治，2007，23（4）：383-390.

[31]Candelier-Harvey P，Hull R.Cucumber mosaic virus genome is encapsidated in alfalfa mosaic virus coat protein expressed in transgenic plants[J].Trans.Res.，1993，2（5）：277-285.

[32]Farinelli L，Maln¨oe P，Collet GF.Heterologous encapsidation of potato virus Y strain P （PVYO） with the transgenic coat protein of PVY strain N （PVYN） in Solanum tuberosum cv[J].Bintje.Bio/Technology，1992，10：1020-1025.

[33]Hammond J，Dienelt MM.Encapsidation of potyviral RNA in various forms of transgene coat protein is not correlated with resistance in transgenic plants[J].Mol.Plant-Microbe Interact，1997，10（8）：1023-1027.

[34]Holt CA，Beachy RN.In vivo complementation of infectious transcripts from mutant tobacco mosaic virus cDNAs in transgenicplants[J].Virology，1991，181（1）：109-117.

[35]Adair TL，Kearney CM.Recombination between a 3-kilobase tobacco mosaic virus transgene and a homologous viral construct in the restoration of viral and nonviral genes[J].Arch.Virol，2000，145（9）：1867-1883.

[36]Borja M，Rubio T，Scholthof HB，et al.Restoration of wild-type virus by double recombination of tombusvirus mutants with a host transgene[J].Mol.Plant-Microbe Interact，1999，12（2）：153-162.

[37]Frischmuth T，Stanley J.Recombination between viral DNA and the transgenic coat protein gene of African cassava mosaic geminivirus[J].J.Gen.Virol，1998，79（5）：1265-1271.

[38]Teycheney PY，Aaziz R，Dinant S，Salanki K，et al.Synthesis of（-） strand RNA from the 3'untranslated region of plant viral genome expressed in transgenic plants upon infection with related viruses[J].J.Gen.Virol，2000，81（4）：1121-1126.

[39]Varrelmann M，Palkovics L，Maiss E.Transgenic or plant expressing vectormediated recombination of Plum pox virus[J].J.Virol，2000，74（16）：7462-7469.

[40]孙婷婷，胡宝忠.转基因植物及其安全性研究进展[J].黑龙江农业科学，2007（2）：72-74.

[41]Crawley M J，Brown S L，Hails R S.，et a1.Transgenic crops in natural habitats[J].Nature，2001，409：682-683.

[42]赵凯，朱宏，赵星海，等.转基因植物环境安全性研究进展[J].生物学通报，2009，44（4）：8-11.

[43]李梦南，郑广宏，王磊.重组基因的生物安全问题及其对策[J].环境与健康杂志，2007，24（12）：1007-1010.