大鼠局灶性脑缺血预处理后激活转录因子4mRNA及其蛋白表达的变化

胡跃强， 唐 农， 董少龙， 毕方方， 祝美珍， 胡玉英， 陈 炜

脑缺血预处理(brain ischemic preconditioning，BIP)是近年发现的重要内源性神经保护机制，可使脑组织对以后较长时间的缺血性损伤产生显著的耐受。最近有研究发现内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)在此环节中发挥了关键作用，其中PKR样内质网激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)介导的未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)信号通路颇为重要，激活转录因子4(activating transcription factor 4，ATF4)是 PERK通路中的重要组成物质。

本研究意在通过检测局灶性BIP后ATF4 mRNA及其蛋白在脑内的表达变化，以进一步研究BIP的神经保护机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组及处理 健康雄性SD大鼠120只，体重250±50g，随机将大鼠分为3组:假手术组(sham-operation，SO)、大脑中动脉缺血组(middle cerebral artery occlusion，MCAO)、脑缺血预处理组(BIP)。每组按照再缺血后12h、1d、2d、3d 4 个时间点平均分为4个亚组(n=10)分别作如下处理:SO组:以假手术代替预缺血及缺血再灌注;MCAO组:以假手术代替预缺血，其余步骤同BIP组;BIP组:MCAO 10min后抽出栓线，完成预缺血，3d后再次行MCAO 2h，再灌注后 12h、1d、2d、3d 处死大鼠。

1.2 动物模型及标本制备 参照Longa的线栓法进行造模。采用大脑中动脉二次线栓法［1］制备大鼠脑缺血预处理模型，结扎大鼠左颈外动脉远端和颈总动脉近端，将前端用火焰烧圆的尼龙线从颈总动脉残端插入，进线约18～20mm，MCAO后10min抽出线栓，完成预缺血。3d后再次行MCAO 2h，再灌注后按规定时间点处死动物取脑。

1.3 缺血半暗带脑皮质ATF4mRNA表达测定

原位杂交法。按试剂盒说明进行操作。采用HMIAS-2000高清晰彩色病理图像分析系统测定ATF4 mRNA原位杂交染色的灰度值，平均灰度值在图像分析中用来表示图像的透光率，最亮为255级，最黑为0级，平均灰度值越高，说明原位杂交染色越浅，mRNA表达越少。主要就顶叶缺血半暗带阳性细胞做比较，每张切片测定4个视野(×400)，取平均值。

1.4 缺血半暗带脑皮质内ATF4蛋白表达测定 大鼠迅速断头取脑，冰上分离缺血侧顶叶大脑皮质约100mg，冰上研磨组织后加预冷的蛋白裂解液，继续碾磨至液态，然后4℃、12000r/min离心30min，留上清液，取40μl用BCA法进行蛋白定量测定，所剩上清液按4∶1的比例加变性5×上样缓冲液，100℃ 水浴10min。取蛋白样品(40μg)采用10%SDS-PAGE垂直电泳(Bio-Rad，USA)进行分离，然后转至硝酸纤维素膜(PVDF)上进行免疫反应。5%脱脂奶粉37℃封闭2h，然后依次加入兔抗ATF4抗体(美国ABcam公司，1∶1000)，37℃ 孵育2h，4℃过夜;偶联有辣根过氧化物(HRP)的羊抗兔IgG(美国Amersham公司，1∶2000)室温孵育2h，加入LumiGLO(20×)发光剂在X-感光盒内曝光。以上反应均在塑料袋内进行，其间用PBS充分洗涤。将胶片进行扫描或拍照，采用HMIAS-2000高清晰度彩色病理图文分析系统进行图像分析，获取各组Western blot条带的平均光密度(OD)值，内参为GAPDH，目的蛋白与内参光密度比值即为目的蛋白的相对值。

1.5 统计学处理 SPSS13.0统计软件处理数据。所有数据用均数±标准差±s)表示，用方差分析进行统计学处理，P＜0.05示差异有显著性。

2 结果

2.1 ATF4 mRNA表达变化 原位杂交显示:SO组有少量ATF4 mRNA表达;MCAO组大鼠脑缺血再灌注后12h顶叶皮质缺血半暗带ATF4 mRNA表达达高峰(P＜0.01)，随再灌注时间延长其表达逐渐下降，但仍保持较高表达水平(P＜0.01);BIP组缺血后各时间点其表达水平较MCAO组均明显下降(P ＜0.05)(见表1、图1)。

2.2 ATF4蛋白表达的变化 Western blot显示:SO组大鼠有少量ATF4蛋白表达;MCAO组12h顶叶皮质缺血半暗带ATF4蛋白表达达高峰(P＜0.01)，随再灌注时间延长其表达逐渐下降，但仍保持较高表达水平(P＜0.01);BIP组缺血各时间点其表达水平较MCAO组均显著降低(P＜0.05，P＜0.01)(见表2、图2)。

表1 大鼠顶叶皮质ATF4 mRNA表达的变化±s，灰度值)ATF4 mRNA 表达

表1 大鼠顶叶皮质ATF4 mRNA表达的变化±s，灰度值)ATF4 mRNA 表达

与SO组比较#P＜0.01;与MCAO组同时间点比较*P＜0.05

组别12h 24h 2d 3d SO组MCAO组BIP组186.32 ±12.69123.53 ±9.21#135.67 ±8.74*191.59 ±11.58134.81 ±10.43#148.55 ±8.86*190.80 ±12.76145.48 ±10.15#159.24 ±9.76*188.76 ±12.27153.35 ±11.05#167.89 ±8.78*

表2 大鼠顶叶皮质ATF4蛋白表达的变化±s，OD值)ATF4蛋白表达

表2 大鼠顶叶皮质ATF4蛋白表达的变化±s，OD值)ATF4蛋白表达

与SO 组比较#P ＜0.01;与 MCAO组同时间点比较*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

组别12h 24h 2d 3d SO组MCAO组BIP组0.823 ±0.0721.624 ±0.129#1.497 ±0.123*0.830 ±0.0751.507 ±0.116#1.389 ±0.105*0.826 ±0.0681.468 ±0.122#1.231 ±0.110＊＊0.834 ±0.0701.325 ±0.113#1.102 ±0.984＊＊

图1 各组2d时ATF4 mRNA的表达(原位杂交，×400)

图2 各组1d时ATF4蛋白的表达(Western blot)

3 讨论

脑缺血预处理(BIP)是指对脑组织采用机械刺激，如一次或多次短暂性脑缺血再灌注后，诱导脑组织产生内源性保护机制，使其对以后较长时间的缺血性损伤产生显著的耐受，这种现象又称为脑缺血耐受。最近有研究发现［2］BIP可激发适当的内质网应激(ERS)，增强细胞耐受后继长时间缺血刺激的能力，延缓或减轻I/R造成的组织损伤，并认为ERS可能是脑缺血细胞损伤的关键环节。ERS激活未折叠蛋白反应(UPR)是引起凋亡的重要因素，存在显著UPR的神经元后来出现凋亡，但机制尚未完全阐明。现已知哺乳动物的UPR信号转导形成了3条互相联系的通路，其中PERK介导的UPR信号通路颇为重要，因为该基因与GRP78解离后活化而引起的eIF2a磷酸化可直接诱发蛋白质合成抑制［3］，并可诱导ATF4等UPR靶基因在缺血后表达［4］，ATF4能结合ATF/CRE元件序列和氨基酸反应元件的核心序列，调节 CHOP［5］和 ATF3 等的［6］表达，诱导细胞凋亡。有关脑缺血动物模型中ATF4表达的研究国内外甚少报道。

Li［7］等制作大鼠MCAO模型，发现再灌注1h在缺血周边区可检出ATF4免疫阳性细胞，再灌注24h达高峰;Rissanen［8］等报道大鼠MCAO模型自发性恢复期间UPR基因的表达情况，该研究将手术组和假手术组动物再分为术后2d、7d、14d、28d等亚组，用原位杂交技术检测相关基因表达，结果发现手术组和假手术组各亚组大鼠不同脑区ATF4基因表达水平无显著性差异。上述研究表明ATF4表达仅在缺血再灌注后一定时间范围内有明显变化。

本研究发现，大鼠脑缺血120min再灌注12h缺血侧顶叶皮质ATF4 mRNA及其蛋白表达即达高峰，随再灌注时间延长其表达逐渐下降，再灌注72h仍可见其高表达，提示大鼠缺血再灌注损伤诱发的ERS可诱导ATF4的表达，与相关研究报道基本一致［7］。而BIP干预后其表达均有明显的下降，提示BIP可能通过影响ERS后ATF4的表达而抑制细胞凋亡，从而保护神经细胞。其机制值得进一步研究。

［1］ 郝玉曼，罗祖明，周 东.局灶预缺血诱导脑缺血耐受的动物模型［J］.中风与神经疾病杂志，2003，20(2):129 －130.

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［3］ Pomar N，Berlanga JJ，Campuzano S，et al.Functional characterization of drosophila melanogaster PERK eukaryotic initiation alpha(eIF2alpha)kinase［J］.Eur J Biochem，2003，270(2):293 － 306.

［4］ Morimoto N，Oida Y，Shimazawa M，et al.Involvement of endoplasmic reticulum stress after middle cerebral artery occlusion in mice［J］.Neuroscience，2007，147(4):957 －967.

［5］ Ma Y，Brewer JW，Diehi JA，et al.Two distinct stress signaling pathways converge upon the CHOP promoter during the mammalian unfolded protein response［J］.J Mol Biol，2002，318(5):1351 －1365.

［6］ Jiang HY，Wek SA，MeGrath BC，et al.Activating transcription factor 3 is integral to the eukaryotic initiation factor 2 kinase stress response［J］.Mol Cell Biol，2004，24(3):1365 － 1377.

［7］ Li F，Hayashi T，Jin G，et al.The protective effect of dantrolene on ischemic neuronal cell death is associated with reduced expression of endoplasmic reticulum stress markers［J］.Brain Res，2005，1048(1):59－68.

［8］ Rissanen A，Sivenius J，Jolkkonen J.Prolonged bihemispheric alterations in unfolded protein response related gene expression after experimental stroke［J］.Brain Res，2006，1087(1):60 － 66.