一株血清7型致病性猪链球菌的分离鉴定

王淑杰，徐 敏，刘永刚，石文达，武嘉男，刘 鹤，何玉利，姜成刚，韩梓峰，蔡雪辉*

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/疫病诊断中心，黑龙江哈尔滨150001；2.广东省农业科学院兽医研究所广东省兽医公共卫生公共实验室，广东广州510640)

猪链球菌(Streptococcus suis)可以导致猪急性败血症、脑膜炎、关节炎、心内膜炎及急性死亡，主要通过伤口和呼吸道等途径导致人感染发病甚至死亡[1-2]。S.suis是一种重要的人畜共患病原，目前已建立了S.suis的血清分型及毒力相关基因的PCR检测方法，但由于非致病菌株也不同程度携带sly、m rp、ef基因或表现血清2型，因此其分析结果仍无法确定致病性。世界范围内S.suis 2型是流行最广泛的一种血清型。近年来，S.suis在我国很多省区流行或暴发，给养猪业造成严重损失。本实验于2007年自黑龙江省五常地区1例病死猪的脑组织中分离一株病原菌，经鉴定为S.suis血清7型。该分离株源于散发感染病例，并且在时间、地域及临床致病性方面具有较好的代表性，对于S.suis血清7型的进化溯源研究具有较大价值，本研究对其病原生物学特性进行系统鉴定和分析，为后续研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌株、病料样品和主要试剂 R735株和标准7型菌株8074株由本实验室保存；病料样品来源于黑龙江省五常地区的病猪脑组织；标准S.suis 1型、2型、7型和9型血清购自丹麦；标准2型菌株革兰氏染液、鲜血琼脂平板、Todd-Hew itt肉汤(THB)和琼脂购自OXOID公司；Taq DNA聚合酶购自宝生物工程(大连)有限公司；细菌DNA提取试剂盒购自TianGen公司；细菌生化反应管购自杭州天和微生物试剂有限公司；纯系斑马鱼购自上海国家斑马鱼模式动物中心；30日龄实验仔猪购自S.suis病原和抗体均为阴性的猪场。

1.2 细菌分离培养与纯化 将病料样品于血平板上划线培养，挑取可疑菌落经液体培养基37℃培养24h。将经PCR鉴定为阳性的菌落在平板上划线纯培养，挑取单个菌落进行PCR鉴定筛选阳性克隆获得纯培养物。

1.3 革兰氏染色镜检 采用常规方法进行革兰氏染色，普通光学显微镜下观察菌体形态。

1.4 生化试验 挑取纯培养的单菌落接种细菌生化微量鉴定管，按照使用说明书37℃培养24h观察结果。

1.5 分离株的PCR鉴定 参照文献[3]合成引物，gdhU：5'-GCAGCGTATTCTGTCAAAC G-3'和 gdhL：5'-CCATGGACAGATAAAGATGG-3'，扩增片段大小为 688bp； cps7U： 5'-AATGCCCTCG TGGAATACAG-3'和 cps7L：5'-TCCTGACACCAGG ACACGTA-3'，扩增片段大小为378bp。分别进行gdh基因检测和cps1、cps2、cps7、cps94个血清型的分型鉴定。PCR反应条件为：95℃5m in；94℃45s、55℃ 45s、72℃ 45s，30个循环；72℃ 10m in。

1.6 血清学鉴定 采用玻板凝集法以适当稀释的S.suis 1型、2型、7型和9型标准血清分别与纯化的单菌落进行玻片凝集试验。

1.7 猪链球菌毒力表型鉴定 用PCR方法检测分离菌株的溶菌酶释放蛋白(m rp)、胞外蛋白因子(ef)、溶血素(sly)基因。PCR反应条件为：95℃ 5min；94℃45s、50℃45s、72℃45s，30个循环；72℃10m in。引物为：m rpU：5'-ATCAG AATCACCACT TTTGG-3'和 m rpL：5'-TCATACCCAGTAAATACA CG-3'，扩增片段大小为885bp；efU：5'-CGCAGAC AACGAAAGATTGA-3'和 efL：5'-AAG AATGTCT TTGGCGATGG-3'，扩增片段大小为 744bp；slyU：5'-GCTTTATTGCGTGCTGAC-3'和 slyL：5'-CTGTTC TCCACCACTCCC-3'，扩增片段大小为1097bp。

1.8 分离株对斑马鱼的致病性试验 采用平板计数器计算细菌浓度，离心沉淀后以等量PBS重悬。取细菌PBS悬液，10倍倍比稀释为5个稀释度，每个稀释度腹腔注射接种50μL接种10尾斑马鱼；同时设等量PBS对照组，分别饲养。接种后96h统计各组斑马鱼死亡数量，按Reed-Muench法计算各菌株的LD50。无菌采取死亡斑马鱼的腹腔脏器进行细菌分离，观察其菌落形态、生长特性和生化特性。

1.9 分离株对仔猪的致病性试验 以109CFU剂量于前腔静脉接种2头仔猪，同时设对照组。接种后连续观察7d，当临床症状结束时采取组织样品(扁桃体、关节、脑脊液、心脏、肝脏、肺、脾、肾、血和脑)涂板分离病菌并进行病理切片。

2 结果

2.1 分离培养与形态学特征 病料样品培养24h后，在血琼脂平板上形成灰白色、半透明、边缘整齐、光滑型的圆形小菌落，直径约为1.0mm，有草绿色狭窄溶血环。染色镜检可观察到散在排列的革兰氏阳性短链球菌(图1)。

2.2 生化鉴定结果 将分离株及标准菌株于细菌生化微量鉴定管中37℃培养24h(表1)。该结果与S.suis生化特性基本一致。

2.3 PCR鉴定结果 以分离株基因组DNA为模板经PCR检测后，S.suis gdh基因的检测结果为阳性，确定为S.suis；S.suis的cps1、cps2、cps7和cps94个血清型的分型鉴定结果为cps7阳性，cps1、cps2和cps9为阴性，因此该分离株为S.suis 7型(图2)。

表1 分离株的发病规律Table 1Disease regulation of isolates in fox

2.4 血清学鉴定结果 分离株与7型S.suis标准血清发生明显的凝集反应，而与1型、2型、9型S.suis标准血清均无凝集颗粒。生化反应、PCR反应及血清学反应均表明该分离株为S.suis，因此根据分离的时间和地点将该分离株命名为S.suis 7型07WC11株。

2.5 毒力因子检测结果 采用PCR方法检测分离株的毒力因子，S.suis 7型07WC11株和标准S.suis 7型菌株8074、标准S.suis 2型菌株R735的毒力因子检测结果见表2。

表2 各菌株毒力因子的检测结果Table 2Detection result of the virulence factor of the strains of S.suis

2.6 对斑马鱼致病性测定结果 分离株对斑马鱼的致病性结果表明该分离株与标准菌株相比致病性较强(表3)。斑马鱼在接种细菌24h后出现临床症状并发生死亡，主要表现为腮部和下腹部出血。所有死亡斑马鱼腹腔脏器均可分离到细菌，其血清型、培养特性、生化特性以及毒力基因等特点均与接种菌株一致。对照组的斑马鱼未表现任何症状。

表3 各菌株LD50测定结果Table 3The LD50 of the strains of S.suis

2.7 对仔猪致病性测定结果 以07WC11株对30日龄仔猪进行致病性试验，结果显示仔猪在接种细菌2d后出现体温升高、耳部发紫、腹泻、消瘦等症状。剖检可见颌下淋巴结和腹股沟淋巴结肿胀出血、肺脏肾脏有出血点。病理切片可见大脑轻度水肿、肺脏小血管内有血栓形成、肺泡隔增宽；肾脏间质内有少量淋巴细胞浸润(图3)；在各脏器均分离到细菌，经鉴定为07WC11株。

3 讨论

在欧洲，法国、意大利、西班牙，S.suis 2型是流行最广泛的血清型[4-6]；而在比利时、荷兰、德国和澳大利亚，血清9型最流行[7-8]；血清7型则在芬兰最流行。在苏格兰，14型是流行最广泛的血清型；而英国则主要是1型和14型流行[5,8]。在北美，加拿大S.suis 2型的比例由22%下降到15%[9]。中国近年来也常有S.suis 2型的报道，而本实验室在近3年的流行病学调查中发现S.suis 7型所占的比例较大，在某些地区甚至超过了2型。S.suis不同血清型菌株之间毒力有较大差异，并非所有的血清型均具有致病性，相同血清型的不同分离株致病特性也不尽相同。S.suis的毒力相关因子包括荚膜多糖、溶菌酶释放蛋白、胞外因子、溶血素、纤连蛋白结合蛋白及膜蛋白转肽酶等，可能在感染致病的不同阶段发挥作用[6,11-13]。此外，有些弱毒株及非致病株也存在某些致病因子，因此，菌株的致病性必须通过对实验动物的致病性进行鉴定。本实验选用斑马鱼作为模式动物，对临床分离的S.suis进行致病性测定，并进行S.suis 7型的致病性测定，结果表明斑马鱼对S.suis 7型易感。

本实验以所分离的7型07WC11株对实验仔猪进行接种，结果表明该分离株具有一定的致病性。但该次致病性试验并未致死仔猪，这可能是由于注射用菌经过多次传代致病力有所下降所致，也可能与接种的剂量及接种的途径有关。本研究分离获得的猪源致病性S.suis 7型07WC11株，毒力比国际标准菌株强，其基本生物学特性、主要毒力基因型与后者无显著差异。该菌株的分离和鉴定为深入研究S.suis 7型的致病性以及其基因组进化奠定了基础，对寻找S.suis 7型的致病因子具有重要价值。

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