大肠埃希菌外膜蛋白酶T毒力机制的研究进展

惠长野，黄胜和，曹虹，张艳芳

1. 深圳市职业病防治院，深圳 518001； 2. 南方医科大学，广州 510515

Omptins家族蛋白是在肠杆菌科细菌中发现的一类定位于外膜的蛋白酶，包括大肠埃希菌外膜蛋白酶T(outer membrane protease T, OmpT)和OmpP、沙门菌PgtE、鼠疫耶尔森菌Pla和福氏志贺菌SopA[1]。它们的氨基酸序列具有高度同源性(45%～80%)，并具有保守的空间构象，由反向平行的β片层包绕而形成中空的桶状结构，锚定在菌体外膜，酶活性中心结构域伸向外膜空间，行使生物学功能[2]。Omptins具有丝氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶特点，脂多糖对酶活性的发挥至关重要[3]。近年来越来越多的研究表明，Omptins与革兰阴性菌毒力相关，但成员之间有较大差异[4]。

编码大肠埃希菌OmpT的基因ompT长久以来被认为是一种管家基因。处于高浓度尿素的细胞裂解液中，OmpT仍保持水解活性，这是引起重组蛋白降解的主要原因[5]。目前，商品化的原核表达宿主菌都是ompT缺陷型。OmpT可能与大肠埃希菌毒力相关，一方面源于Omptins家族Pla及PgtE被证明是耶尔森菌和沙门菌重要的毒力因子；另一方面主要来源于大量的流行病学分析数据，如不同国家和地区学者收集到的尿路致病性大肠埃希菌(uropathogenicEscherichiacoli, UPEC)中OmpT都有很高的检出率，认为其可能是泌尿道感染的细菌毒力因子[6-8]。有研究表明，OmpT在大肠埃希菌脑膜炎分离株中的分布高达96%，显著高于其他典型脑膜炎致病毒力因子[9]。皮肤和软组织感染相关的102株大肠埃希菌分离株中，80%携带有OmpT，而其他毒力因子检出率最高的CNF1仅为32%[10]。

大肠埃希菌OmpT作为多功能蛋白，以多机制参与细菌感染侵袭过程。目前，对其致病机制的研究主要集中在以下几个方面：①通过发挥蛋白酶活性，参与毒力因子前体加工；②降解宿主细胞分泌的抗菌肽，有利于细菌在体内存活；③通过激活纤溶酶原降解细胞外基质，从而促进侵袭；④OmpT本身作为细菌黏附因子介导黏附侵袭过程；⑤可能与一些毒力基因的表达调控相关。

1 尿路感染与UPEC

尿路感染是继呼吸道感染的机体第二大易感染疾病，病原体以UPEC为主[11]。尿路感染多发于机体免疫力低下者，以及膀胱、肾远球小管等部位生理或功能紊乱的人群[7]。健康人中尿路感染并不常见，这与人体完善的防御机制有关。无菌尿液的冲刷不断清除少量入侵细菌，避免上行感染发生，同时天然免疫构成了机体的主要防线。尿路上皮细胞可分泌多种蛋白以抵御微生物入侵，已知的有Tamm-Horsfall、乳铁蛋白(lactoferrin)和脂钙蛋白(lipocalin)，这些黏蛋白覆盖于上皮细胞表面，不利于致病菌黏附。组成型和诱导型抗菌肽，如α防御素(α-defensin)、β防御素、抗菌肽(cathelicidin)等的分泌，可直接杀伤侵入的病原菌[12,13]。尿路上皮同时存在2类分子：一类是受体分子(细胞表面结构、单纯蛋白、糖蛋白等)，可识别并结合特异性的致病菌黏附相关因子；另一类是效应分子，包括抗菌肽类和一些可快速中和入侵病菌的蛋白，化学因子及细胞因子的分泌可诱导吞噬细胞向感染部位聚集，激活后吞噬能力大大提高[14]。

尿路感染好发于女性，与其尿路解剖生理有关，女性尿道短，尿道口在会阴部和肛门附近。UPEC易沿尿道上行，借助1型菌毛等黏附因子定植于膀胱。如何突破天然免疫防御并成功侵袭膀胱上皮细胞是实现感染的关键[15]。FimH、CNF1、SurA、OmpA等已通过细胞模型和动物模型证实与UPEC黏附侵袭毒力相关[11,16]。OmpT、KpsMT等在粪大肠菌群中也有较高分布，但在UPEC中有更高的检出率，是否与UPEC毒力有关还有待相关研究证实[6,7,9]。

2 OmpT的底物与切割位点

OmpT是引起外源重组蛋白降解的最重要蛋白水解酶，可从已鉴定的OmpT底物来推测其在体内的生理功能[17]。表1列出已证实的OmpT底物肽或蛋白的作用位点，可看出OmpT主要识别并水解由碱性氨基酸Arg和Lys残基组成的肽键，而旁侧氨基酸序列特征性不强[17]。携带有α溶血素(α-hemolysin, HlyA)信号肽的融合蛋白，分泌过程中通过大肠埃希菌外膜时被OmpT剪切去除信号肽[18]。OmpT参与霍乱弧菌毒素蛋白前体的翻译后加工[19]。从已有的研究报道推测，OmpT可能与某些毒力因子前体分泌过程的剪切加工有关。

表1 已鉴定的OmpT底物及识别序列Tab.1 Substrates and cleavage sites of OmpT

近年来研究表明，水解阳离子抗菌肽和抵抗宿主天然免疫防御体系可能是OmpT的主要生理功能之一[20, 21]。鱼精蛋白主成分salmine AI富含连续精氨酸，ompT+株表现出对其明显的抗性，salmine AI已作为OmpT体外活性测定的最适底物[3]。在机体正常情况下，天然免疫重要效应分子抗菌肽始终维持较低水平表达。当致病菌入侵时，抗菌肽被迅速诱导至一个高水平表达，进而发挥抗感染作用[13]。在感染初期，通常在几分钟至几小时，天然免疫激活，在入侵病原菌复苏及繁殖之前，就将其完全清除，且不引起明显的炎症反应[7]。相比之下，适应性免疫(高度专一的抗体、T细胞受体依赖的淋巴细胞等)在彻底消灭病原体及防止再感染方面有重要意义[13]。

防御素在病原体入侵时可迅速诱导表达，OmpT被证实与UPEC抵抗这类抗菌肽密切相关，有利于细菌在尿路中存活而引发感染[20]。对防御素这类广泛分布于动植物界的阳离子抗菌肽序列进行分析，富含碱性氨基酸及半胱氨酸是防御素的共性。表2列举了已鉴定的人源防御素序列，这些连续碱性氨基酸残基形成的肽键作为OmpT水解灭活的位点还有待证实。但最新研究成果很好地支持了这一假说，肠出血性及肠致病性大肠埃希菌OmpT被证实与LL-37抗性有关，质谱表明OmpT正是作用于LL-37的2个假定水解位点(图1A)[22]。底物抗菌肽二级结构和假定水解位点如图1所示(PyMol软件作图)。此外，Omptins家族成员OmpP和PgtE也被证实与抗菌肽抵抗有关[23,24]。

ZF-RNase-3是来源于斑马鱼的RNA酶，同时具有杀菌活性。 进一步的研究发现，ZF-RNase-3

A: LL-37 (PDB ID: 2K6O)，LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES；B: β-defensin-2 (PDB ID: 1E4Q)，PVTCLKSGAICHPVFCPRRYKQIGTCGLPGTKCCKKP；C: α-defensin-1 (PDB ID: 3LO4)，ACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC.

表2 已鉴定的人源防御素氨基酸序列Tab.2 Amino acid sequences of human defensins

需利用病原体蛋白酶的加工才能生成具有抗菌活性的肽段，OmpT被证实是这一环节的关键酶[25]。这可能是病原体与宿主协同进化的结果。OmpT不仅作用于宿主抗菌肽，还可作用于细菌素。ColE2是大肠埃希菌分泌的、具有杀菌活性的内切酶，ColE2与免疫蛋白Im2由细菌以聚合体的形式分泌，有效降低了ColE2对产生菌自身的杀灭活性，更重要的是防止OmpT对ColE2的水解灭活[26]。

3 OmpT与细菌毒力

3.1 OmpT激活纤溶酶原活性

纤溶酶在体内具有抗凝及降解细胞外基质的活性，许多致病菌都产生并利用纤溶酶原激活剂作用于凝血系统，一些致病株利用表面受体结合纤溶酶(原)并使酶激活免受生理抑制，有利于其突破正常组织屏障[27]。大肠埃希菌外膜组分被证实具有激活纤溶酶原的活性，OmpT与耶尔森菌的纤溶酶原激活剂Pla同源性达47%[28]。McCarter 等[17]利用噬菌体展示肽库研究OmpT的底物专一性，确定OmpT识别位点上下游6个氨基酸的分布概率，其中包括天然纤溶酶原激活位点。纯化的OmpT蛋白最终被证实是纤溶酶原的弱激活剂[29]。

凝血系统的激活是机体抗感染机制之一，纤维蛋白沉积可有效阻止病原体侵袭扩散，激活纤溶酶原是病原体的抵抗策略之一[27]。来源于人体的内源性抗凝剂——组织因子途径抑制剂(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)被证实是Omptins的理想底物，Pla、OmpT和PgtE对其水解灭活的速率甚至高于对纤溶酶原的激活[30]。这可能是人体TFPI在长期进化过程中产生对抗病原体抗凝的机制，也是严重感染引发败血症患者出现血管内弥散性凝血的原因之一。

3.2 OmpT提高细菌黏附活性

ompT敲除可导致新生儿脑膜炎大肠埃希菌分离株RS218在体外黏附脑微血管内皮细胞的能力下降20%[31]。UPEC临床分离株CFT073缺失ompT，重要的菌毛黏附因子FimH等毒力因子表达不受影响，但体外黏附人膀胱上皮细胞及体内定植小鼠膀胱的能力显著降低[32]。ompT敲除株回补ompT表达质粒及ompT点突变致酶活性丧失质粒，菌株黏附能力均得到恢复，提示OmpT对菌株黏附能力的影响不是通过酶活性介导的[33]。OmpT具有蛋白水解活性，不同于一般的细菌黏附因子，上皮细胞中OmpT相互作用蛋白的分离和鉴定有利于OmpT介导细菌黏附详细机制的阐明。

菌毛黏附因子介导微生物黏附侵袭在致病性大肠埃希菌中较常见。在致新生儿脑膜炎大肠埃希菌分离株中可被唾液酸半乳糖苷识别的S型菌毛很普遍，但其在脑膜炎发病中的作用还未充分阐明[31]。Parkkinen等[34]研究表明，SfaA可捕获纤溶酶原并促进酶原激活，降解细胞外基质，促进细菌穿越基底膜。OmpT及SfaA在纤溶酶原激活过程中是否存在协同作用，有待进一步研究。

3.3 OmpT的表达调控

ToxR是霍乱弧菌的一种跨膜DNA结合蛋白，它至少参与了17个毒力基因的表达调控。ompT是已知唯一被其下调的毒力基因。关于OmpT在致病过程中的表达调控，知之甚少。Li等研究表明，ToxR直接结合到ompT启动子A/T富集区，在转录水平抑制OmpT表达，cAMP受体蛋白可激活OmpT表达[35]。在216株UPEC中，ompT与kpsMT、cnf1、sfa、prf这些毒力基因遗传学上并非紧密连锁，推测在功能及调控上相关[8]。不同来源的ompT+株对同种抗菌肽的抵抗能力并不相同，各分离株中ompT转录水平存在较大差异。相当一部分ompT+株中OmpT一般情况下并不表达[5,20]。最新研究指出，抗菌肽接触病原体后，与抗性相关的基因表达可迅速上调[22]。针对不同感染组织内环境的差异，细菌在与宿主长期斗争中进化了一套精密的表达调控机制。

4 结语

OmpT是一种毒力相关因子，与大肠埃希菌尿路感染相关。作为一种多功能蛋白，抵抗宿主阳离子抗菌肽、激活纤溶酶原是其重要的生理功能。此外，OmpT是否以黏附因子的身份介导细菌侵袭还有待进一步研究。随着细菌对抗生素的耐药日趋严重，人们对抗菌肽寄予厚望，而对OmpT这类蛋白酶毒力机制的深入研究有利于新型耐酶抗菌肽的设计，也为探寻新的抗感染途径、筛选新药作用靶点提供了可能。

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