人类免疫缺陷病毒潜伏库的形成与清除

何涌泉，孟哲峰，张晓燕

上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心，上海 201508

尽管高效抗反转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy, HAART)抗人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染较成功，但其只能抑制(suppression)体内病毒，要完全清除(eradication)病毒仍是一个遥远的目标，主要原因是病毒潜伏库(latent viral reservoir)的存在[1]。病毒潜伏库是指在体内免疫系统和外来药物的高压下，病毒选择隐藏于宿主的细胞或解剖学场所(一般位于二级淋巴结、中枢神经系统、睾丸等部位)。对HIV感染者来说，此时的病毒不复制或只有低水平复制能力，通常的抗病毒治疗方法无法有效攻击潜伏库中的病毒。而一旦停止用药，潜伏库的病毒将有机会再次复制和扩增，导致体内病毒载量迅速反弹[2]。因此，深入研究HIV潜伏库的形成机制，有助于探索有效的病毒潜伏库清除或控制方法，减缓艾滋病疾病进展，提升临床抗病毒治疗的效果。

1 HIV潜伏感染的形成

当进入宿主细胞后，HIV通过将病毒RNA反转录成cDNA形成整合前复合体(preintegration complex, PIC)，整合到宿主基因组后，多数成为前病毒(provirus)，随宿主细胞基因组复制而产生子代病毒。小部分则由于所在宿主细胞处于G0期而潜伏，只有受某种刺激后才重新开始复制。这种细胞非常少，大约占整个外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)总数的百万分之一，却是HIV难以根除的关键原因。

潜伏形成后，HIV大致有3种存在形式：一种是以PIC的形式存在于细胞质内，并未整合入细胞核内，该状态下PIC可能会被细胞降解，然而一旦细胞在PIC降解之前被活化，会导致HIV整合与复制；第2种是PIC进入细胞核，但没有整合到人类基因组内，而是在核内呈游离状态，大多数通过重组形成只有一个长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)区的1-LTR HIV环，极少部分在DNA连接酶作用下将两端LTR连接形成类似质粒结构的2-LTR HIV环[3, 4]；第3种是成功将自己整合进人类基因组中[5]，但概率很低。虽然HIV形成这3种状态的机制不相同，但都成功逃避了宿主免疫系统攻击及药物清除，与细胞共生；同时，这些细胞一般都处于G0期，为静息细胞，一旦受抗原、细胞因子等刺激，会成为效应细胞，使病毒具有复制活性并产生病毒颗粒(图1)。

病毒潜伏的形成可能与染色体的结构变化有关系。有研究发现，核小体在其中扮演重要角色。当HIV DNA整合进常染色质时，nuc-0、nuc-1和nuc-2会被其5′ LTR包裹，由于这些核小体与转录因子的结合位点重叠，阻止转录因子接近，使转录无法进行。转录激活蛋白(transactivator protein, Tat)能结合染色质改构复合物SWI/SNF，使染色体结构变化，暴露出相应位点而进行转录[6, 7]。SWI/SNF在HIV潜伏周期中所发挥作用的具体机制尚不明确。

图1 HIV-1 DNA基因整合及调控示意图Fig.1 Genome integration and regulation schematic diagram of HIV-1 DNA

不同的核因子κB( nuclear factor κB，NF-κB)/Rel家族在维持HIV-1潜伏中也起重要作用。P50蛋白能招募组蛋白去乙酰化酶到HIV-1的LTR区，促进染色质凝聚并抑制RNAPolII靠近[8, 9]。在白细胞介素7(interleukin 7，IL-7)诱导的记忆CD4+T细胞自我更新时，低水平NF-κB分子活化及T细胞受体(T cell receptor，TCR)信号通路均能促进bcl-2、bclxl等抗凋亡基因表达[8]。此外，IκB激酶能磷酸化转录因子FOXO3a，阻断对凋亡基因的诱导[10, 11]。这些分子的混合作用使记忆CD4+T细胞长久生存，并维持病毒潜伏库的存在。

2 HIV潜伏库的细胞来源

HIV潜伏库有2种来源，一种是HIV DNA未整合入人类基因组，而是游离于细胞质或细胞核中，尤其是游离于细胞核中的1-LTR HIV和2-LTR HIV能进行稳定的低水平复制[12]。体外细胞实验发现，抑制整合酶可增加细胞内2-LTR HIV比例，最多可达600拷贝/100万PBMC。另一种是完全整合的细胞库，有较高的稳定性和隐蔽性，是完全清除HIV感染的主要障碍。由游离HIV DNA组成的潜伏库在病毒复制中扮演主要角色，由于一直保持着低水平复制活性，在停止治疗后，可能会通过激活细胞来唤醒其余HIV[4]。

HIV潜伏的细胞包括记忆CD4+T细胞、纯真CD4+T细胞、神经胶质细胞、星形胶质细胞[5]、自然杀伤细胞及多功能造血干细胞等[13]。其中记忆CD4+T细胞的2种亚型是潜伏库最主要的部位，分为中央记忆T细胞(central memory T cell)和过渡性记忆T细胞(transitional memory T cell)。大部分HIV潜伏于中央记忆T细胞，但过渡性记忆T在体内存在的时间更长且不断更新[5]。这些潜伏细胞来源大概分为3类：一类为感染的效应细胞存活下来并转化为记忆细胞；一类是在各种趋化因子作用下HIV直接感染纯真CD4+T细胞等而形成；最后一类则是由潜伏细胞繁殖或分化形成[14-16]。

3 HIV潜伏库的清除

HIV潜伏库的控制主要涉及整合酶抑制剂的应用、潜伏病毒的识别、潜伏病毒的激活及病毒潜伏细胞激活后的识别等。主要采用组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor, HDACi)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)调节剂、甲基化抑制剂等激活潜伏病毒复制，使之暴露于外源性抗病毒药物及免疫系统攻击之下。

3.1 HDACi

染色质的组蛋白乙酰化和去乙酰化是调节基因表达的关键环节，而异常基因表达是遗传和代谢疾病发生的分子生物学基础。组蛋白的乙酰化程度由组蛋白乙酰化酶和去乙酰化酶协调控制[17]。组蛋白的乙酰化能改变染色体结构，使转录因子接近HIV LTR区域而启动转录活动；而组蛋白去乙酰化酶能调节染色体构象，抑制基因表达，有利于HIV处于潜伏状态。

第1个通过美国食品药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)审查的HDACi药物是伏立诺他(vorinostat)，即辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA)，用于治疗皮肤T细胞淋巴癌。虽然SAHA会引起体内DNA损伤，但能被正常细胞修复[18, 19]；同时，在长期接受SAHA刺激的细胞中没有观察到DNA突变[20]。体外实验发现，该药物能在不活化细胞的情况下激活HIV复制活性，使病毒感染细胞能被免疫系统或药物识别并清除[21]。目前，已有文献为SAHA作为药物使用提供了“概念型”(proof-of-concept)的依据，该实验采用分离自持续治疗患者的静息CD4+T细胞，证明SAHA能有效激活HIV RNA表达，且体内实验显示增加SAHA浓度(200 mg→400 mg)时机体表现出良好的耐受能力[20]。但在其他实验中观察到，CD4+T潜伏细胞活化后不会因为HIV复制而引发由病毒导致的细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)，也不会被普通CD8+细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)识别并清除，只能被经特殊抗原刺激过的CD8+CTL清除[22]。而体内实验中，HIV特异性的CD8+T细胞所介导的清除对HIV潜伏细胞识别程度并不高，其杀伤能力也有所下降[23]。因此，对CD8+T细胞杀伤机制的研究有助于理解清除HIV潜伏细胞的方式。

目前，帕比司他(panobinostat)、恩替诺特(entinostat)及ITF2357(givinostat)等HDACi药物正以治疗癌症为目的进行2期或3期临床试验。最近研究表明，在HIV潜伏的T细胞模型中，这些药物都能激活潜伏HIV的复制，其中ITF2357能减少CD4+T细胞CXCR4和CCR5的表达[24]。还有一些新开发的HDACi在体外实验中能激活潜伏HIV的活性，包括MCT-1、MCT-3、CG05和CG06，但需更多、更深入的动物模型来验证。

3.2 PKC调节剂

PKC能通过多种方法启动HIV转录。首先，PKC可活化转录因子NF-κB来诱导HIV转录，PKC激活后将诱导NF-κB的抑制蛋白IκB-α磷酸化和不完全降解，使NF-κB与IκB解离，解离出来的NF-κB与HIV LTR区的多个位点结合，使转录进行。其次，PKC能激活活化蛋白1(activator protein 1，AP-1)，使其与HIV启动子结合。最后，通过促进Tat转录因子与细胞反式激活应答(trans-activation response，TAR)元件结合，促使HIV转录开始[25-27]。

体外实验中，酪氨酸激酶抑制剂(prostratin)不仅通过激活PKC而激活潜伏HIV的复制，还能与HDACi类药物发挥良好的协同作用[28]。半合成酪氨酸激酶抑制剂已研制成功[29]，但酪氨酸激酶抑制剂不能特异性针对HIV产生激活作用，目前也缺乏临床数据来证明其功效。

作为酪氨酸激酶抑制剂结构类似物的格尼迪木任(又称尼地吗啉, gnidimacrin)，是从瑞香狼毒中分离得到的二萜类化合物[30]，目前主要作为抗肿瘤药物进行研究。有研究表明，其能在部分细胞系中展现出比酪氨酸激酶抑制剂更高的激活病毒复制的能力，也能通过下调CCD5表达来抑制R5病毒株感染[31]。但其在MT4细胞系中的表现不太理想，同时抑制的病毒株过于单一，是否能扩大作用范围，包括细胞系、病毒株等，仍缺乏实验数据。

最近发现苔藓抑素(bryostatin)能激活PKC和AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)途径以再度激活潜伏HIV的DNA[25]，尤其当其与CD4抗体包裹形成纳米颗粒后，能高效定位到CD4+T细胞并激活潜伏病毒[32]。

PKC抑制剂如卡马拉素(rottlrein)能抑制PKCθ在T细胞中表达，最终抑制HIV复制[33]。然而对该类药物的研究不多，能否应用于临床还有待进一步评估。

3.3 甲基化抑制剂

DNA甲基化是指DNA甲基转移酶将S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移给胞嘧啶的过程。研究表明，DNA甲基化是维持HIV潜伏的主要机制之一。在HIV 5′ LTR的转录起始位点有2处CpG岛甲基化修饰序列，抑制转录因子接近目标DNA的启动子[34]，使HIV进入潜伏状态。DNA甲基转移酶抑制剂(DNA methyltransferase inhibitor，DNMTi)可能具有激活HIV的能力。有资料表明，记忆CD4+T细胞中出现大量过度甲基化情形，而静息CD4+T细胞没有该现象发生[35]。这可能因为甲基化是发生在HIV-1 DNA整合之后并加强基因沉默效果的机制，而非推动HIV-1在核细胞内主动进入潜伏期。

最近对5-脱氧氮杂胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine, 5-Aza-dC)的研究表明，该药物在不同细胞系中发挥不同作用[36]。当5-Aza-dC与HDACi共同作用分离自HARRT治疗患者的CD4+T细胞时，显示有高效激活作用。因此，需对该类药物进行更多的HIV甲基化研究，从而明确其特异作用靶点，有效识别HIV DNA重组位点，为HIV潜伏库清除研究提供科学依据。

3.4 位点特异性重组

位点特异性重组是遗传重组的一类，该重组发生仅需一小段同源序列即特异性位点(又称附着点，attachment site，att)和识别该位点的特异重组酶参与，并不需要Rec蛋白[37]。当一段基因存在2个特异位点时，根据这2个位点方向，重组酶能决定位点之间DNA发生整合、倒位、易位或切除的4种结果。当特异位点方向相同，位点之间的DNA将发生易位、整合或切除；当特异位点方向相反，则发生DNA倒位。其中，切除和倒位由于动力学原因更易发生[38]。目前研究者期望通过在细胞内表达一种能特异识别HIV序列的重组酶，敲掉整合到人类基因组的HIV DNA。

研究发现，噬菌体P1的Cre/loxP体系的识别位点与HIV LTR区具有相似性。Sarker等因此构建了Tre/loxLTR体系，通过新构建的Tre重组酶(Tre-recombinase)识别一段34对碱基序列的loxLTR区域[39]。目前研究使用从HIV Tat中分离的一段蛋白转导域(protein transduction domain, PTD)肽段[40]或从乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)PreS2蛋白分离的一段细胞渗透转运基序(cell-penetrating translocation motif)作为载体[41]，将Tre转运进细胞。虽然在细胞水平实验中获得较高效率，能有效将HIV DNA从基因组清除[42]，但目前并没有更多的实验数据证实其在体内的效果，且Tre重组酶的活性仍是个问题。

3.5 细胞因子

细胞因子被提出作为HIV治疗药物已有15年历史。目前加强对HIV感染者免疫效率的研究更关注于多种细胞因子的联合使用，包括IL-2、IL-7、IL-15等。单一细胞因子或作用微弱，或靶细胞太少，无法发挥较为全面的疗效。其中占主要地位的可能是IL-7，这是因为IL-7比IL-2更能增强HIV的复制活性，且单独使用IL-2可使调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)增殖并抑制CD8+T细胞的活化和杀伤能力[43]。IL-7能诱导来自患者PBMC中的HIV复制。在SCID-hu小鼠实验中发现，在病毒治疗期使用最大剂量IL-7(>10 μg/kg)，能检测到明显的病毒信号(viral blip)[44]。但在部分体外实验中，IL-7仅表现出微弱效果，这可能与HIV感染的不同细胞系有关，且IL-7可能增加血清中HIV RNA含量[45]。IL-15能通过诱导记忆细胞分化来激活HIV的复制活性，但具体应用仍面临诸多问题，包括诱导强度、靶细胞单一等。

4 结语

HIV潜伏库清除药物研究中的问题大致有两方面：一是无法做到特异性识别；二是激活效率不高。大多数机制是直接通过表观遗传学的方法进行活化，或活化T细胞，或活化沉默基因，无法特异性识别HIV DNA结合位点。而位点特异性重组虽能识别HIV DNA结合位点，但效率较低，可供参考的数据不多。作为最新研究HIV潜伏机制的热点，微小RNA(microRNA)最近多次出现在各种艾滋病大会议程中，但大多数研究尚处于进展之中，未见相关发表文章，故不叙述。

目前，研究HIV如何长期存在于HARRT治疗中的患者，有了不少进展，但完全清除潜伏库中的感染细胞或病毒仍是难题。虽然已有不少药物在体外展现良好的作用，部分药物甚至已批准用于治疗其他疾病，但没有足够数据证明其在HIV感染者中能发挥相应的活性。

采用联合用药清除体内HIV是最好的选择，因为越来越多的证据表明，一个有效的治疗方法不仅在于对潜伏HIV的激活，还在于对HIV潜伏细胞的识别清除[46]。应首先证明这些药物在体内能有效针对潜伏细胞产生作用，而这需更多临床试验及相应资金支持。因此，HIV潜伏库是治疗HIV感染中不能逃避的问题，同时也是最大的挑战。

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