一氧化氮在休克大鼠离体淋巴管对P物质反应性中的作用*

司永华，牛春雨，秦立鹏，赵自刚，张 静

(河北北方学院微循环研究所，基础医学院病理生理学教研室，河北 张家口 075029)

淋巴循环是循环系统的重要组成部分，淋巴管收缩性是淋巴循环的动力。整体动物实验表明，失血性休克(hemorrhagic shock，HS)早期淋巴管收缩性升高、后逐渐下降［1］，淋巴管收缩功能状态与休克转归相关［2］;一氧化氮(nitric oxide，NO)的周期性变化参与了淋巴管生理状态下的收缩、舒张以及张力调节［3－4］，且NO参与了休克离体淋巴管收缩性双相变化的调节［5］。进一步研究发现，休克2 h整体动物与离体淋巴管对缩血管物质去甲肾上腺素的反应性均下降，其机制与钙敏感性降低有关［6－7］;P物质(substance P，SP)作为一种与淋巴组织感觉神经支配有关的神经肽，不仅对正常淋巴管平滑肌具有重要的正性肌力和变时性作用［8］，同时，还可增加休克各期离体淋巴管的泵功能［9］，休克离体淋巴管对SP的反应性呈双相变化。但NO是否参与了休克离体淋巴管反应性的双相变化?这也是针对淋巴管反应性调控淋巴管收缩性的切入点之一，值得关注。本实验应用离体淋巴管灌流技术，观察NO/一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)工具药对休克离体淋巴管反应性的影响，探讨NO在休克淋巴管反应性中的作用。

材料和方法

1 材料

1.1 动物与主要试剂 SPF级雄性Wistar大鼠42只，体重250～300 g，购自中国军事医学科学院实验动物中心;L－精氨酸(L－arginine，L－Arg)购于Sigma;1H －［1，2，4］恶二唑［4，3 －a］喹喔啉 －1 － 酮(1H －［1，2，4］oxadiazolo［4，3 － a］quinoxalin －1 －one，ODQ)购于Sigma;L－硝基－精氨酸甲酯(NG－nitro－L－arginine methyl ester，L－NAME)购于 Sigma;氨茶碱(aminophylline，AP)购于 Sigma;SP购于Alexis。

1.2 主要仪器 CH/2型微血管压力－直径测定仪(Living Systems Instrumentation，LSI);PS/20 型压力伺服系统(LSI);TS100型倒置显微镜(Nikon);NE－1000型程控微量抽注泵(New Era Pump Systems Inc.);308/opt－o型视频卡尺(Colorado Video Inc.);SSZ型手术显微镜(上海光学仪器厂);RM6240BD型生物信号采集处理系统(成都仪器厂)。

2 方法

2.1 失血性休克模型的复制 大鼠经1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)肌肉注射麻醉后，常规方法分离右侧股静脉和股动脉，股静脉注射肝素钠(500 U/kg)全身抗凝，股动脉插管并通过生物信号采集处理系统监测平均动脉血压(mean artery pressure，MAP);同时，分离左侧股动脉，插管后连接注射器固定于抽注机上备放血用。待所有手术完成、稳定30 min后，经左股动脉、应用抽注机缓慢匀速放血，10 min内将MAP降至40 mmHg，实验中通过调整放血量维持MAP在(40±2)mmHg水平，复制HS模型。其中，18只动物在低血压0.5 h制备离体淋巴管条，作为休克0.5 h组;18只动物在低血压2h制备离体淋巴管条，作为休克2 h组;其余6只动物仅麻醉、手术，作为对照组(control)。

2.2 离体淋巴管条的制备、固定与稳定 所有大鼠在相应时点，腹腔注射大量戊巴比妥钠(120 mg/kg)后，按我们方法［5，9］，取出胸导管，去除周围组织，制备离体淋巴管条;将淋巴管条移入预先充有PSS缓冲液的微血管压力－直径测定仪的浴槽内，将淋巴管两端嵌套于浴槽内2个直径相匹配的毛细玻璃管(450～550 μm)，尼龙丝线结扎两端固定，检查胸导管壁有无渗漏、损伤和扭转;通过压力伺服系统设置压力为3 cmH2O，待其温度自然升到室温，然后再30 min将温度逐渐加热到37℃［10］。淋巴管出现自发性收缩后稳定30 min(若无自发性收缩则弃去)，然后换1次液，以减少由于蒸发而引起的渗透压变化［11］。

2.3 与NO工具药共孵育 将出现自发性收缩的休克0.5 h淋巴管分别与L－Arg、L－Arg+ODQ孵育5 min(分别为休克0.5 h+L－Arg组、休克0.5 h+L－Arg+ODQ组);休克2 h淋巴管分别与 LNAME、L－NAME+AP孵育5 min(分别为休克2 h+L－NAME组、休克2 h+L－NAME+AP组)，均n=6。其中，L－Arg浓度为 1×10－3mol/L，ODQ、L－NAME和AP浓度均为1×10－5mol/L。

2.4 离体淋巴管收缩反应性观察 各组淋巴管在跨壁压3 cmH2O下、稳定10 min、出现稳定的自发性收缩后，休克0.5 h、休克2 h各12根淋巴管条分别与NO工具药孵育5 min后，记录淋巴管的收缩频率(contraction frequency，CF)、舒张末期口径(end － diastolic diameters，EDD)和收缩末期口径(end－systolic diameters，ESD)，待每条淋巴管收缩性观察结束后，将其在无钙PSS缓冲液中孵育15 min，测得淋巴管的最大被动舒张口径(passive diameters，PD)。结合文献［3，10－11］，计算紧张性指数(tonic index，TI)、收缩幅度(contraction amplitude，CA)、泵流分数(fractional pump flow，FPF)，其中:TI=(PD －EDD)/PD ×100%;CA=(EDD－ESD)/PD×100%;FPF=(EDD2－ ESD2)/EDD2× CF。以 CF、TI、CA 和 FPF作为淋巴管收缩性的指标，以本次数据作为淋巴管收缩的基础数值。随后在各组淋巴管的浴槽中依次从低到高浓度加入SP母液，使浴槽中SP终浓度为10－8、3 ×10－8、10－7和 3 ×10－7μmol/L，在每次加入SP 1 min后，分别记录 CF、SDD 和 ESD，计算 TI、CA和FPF等收缩性指标。以在每一SP浓度下的CF、TI、CA和FPF与未加SP前淋巴管基础值的差值ΔCF、ΔCA、ΔFPF 和 ΔTI，作为淋巴管对 SP 反应性的指标，评价NO对休克淋巴管反应性的作用。

3 统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件包，计量数据以均数±标准差()表示，首先进行方差齐性检验，方差齐的资料多组间比较采用单因素方差分析，方差不齐的资料采用Kruskal－Wallis检验。

结 果

1 NO对休克淋巴管ΔCF的影响

如图1所示，休克0.5 h组淋巴管的ΔCF在SP浓度为 1×10－8mol/L、3×10－8mol/L 和 1 ×10－7mol/L时均显著高于对照组(P＜0.01)，用L－Arg孵育后，ΔCF显著降低(P＜0.05);与 L－Arg和ODQ同时孵育后，ΔCF升高至未加药组水平，且在SP浓度为1×10－8mol/L和3×10－8mol/L时显著高于对照组，在SP为1×10－8mol/L时显著高于休克0.5 h+L－Arg组(P＜0.05，P＜0.01)。

休克2 h淋巴管ΔCF在SP浓度为3×10－7mol/L时低于对照组(P＜0.05);而用L－NAME孵育后，ΔCF显著增高(SP浓度为3×10－7mol/L除外)，且在SP浓度为3×10－8mol/L时，显著高于对照组(P＜0.05，P＜0.01);与 L－NAME和AP同时孵育后，在各浓度SP下，ΔCF呈下降趋势，与未加药组相比差异无统计学意义，但在1×10－8mol/L和3×10－8mol/L时显著低于休克2 h+L－NAME组(P＜0.05)。

Figure 1.Effects of ODQ and/or L －Arg，aminophylline(AP)and/or L －NAME on Δcontraction frequency of lymphatics after hemorrhagic shock.ΔContraction freguency:the maximal change in contraction freguency after the administration of SP..n=6.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05 vs shock 0.5 h;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs shock 2 h;□P ＜0.05 vs shock 0.5 h+L－Arg;▲P＜0.05 vs shock 2 h+L－NAME.图1 ODQ和/或L－Arg、AP和/或L－NAME对休克淋巴管ΔCF的影响

2 NO对休克淋巴管ΔTI的影响

由图2可见，休克0.5 h组淋巴管的ΔTI在SP浓度为3×10－8mol/L时显著高于对照组(P＜0.05);休克0.5 h组淋巴管与L－Arg孵育后，在SP为3×10－7mol/L和1×10－7mol/L时，ΔTI显著降低(P＜0.05，P＜0.01);休克0.5 h组淋巴管与LArg和ODQ共孵育后，ΔTI呈上升趋势，达对照组水平，且在SP浓度为1×10－7mol/L时显著高于休克0.5 h+L－Arg组(P＜0.05)。

休克2 h组淋巴管的ΔTI在SP浓度为1×10－7mol/L时显著低于对照组(P＜0.05);与L－NAME孵育后，在不同浓度SP时，ΔTI出现增高趋势，在1×10－8mol/L和3×10－8mol/L时显著高于对照组与休克2 h组(P＜0.05，P＜0.01);休克2 h组淋巴管与L－NAME和AP共孵育后，ΔTI在SP为1×10－8mol/L和3×10－8mol/L时显著低于休克2 h+LNAME 组(P＜0.05，P＜0.01)。

Figure 2.Effects of ODQ and/or L － Arg，aminophylline(AP)and/or L － NAME on Δtonic index of lymphatics after hemorrhagic shock.Δtonic index:the maximal change in tonic index after the administration of SP..n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs shock 0.5 h;△P＜0.01 vs shock 2 h;□P＜0.05 vs shock 0.5 h+L－Arg;▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs shock 2 h+L－NAME.图2 ODQ和/或L－Arg、AP和/或L－NAME对休克淋巴管ΔTI的影响

3 NO对休克淋巴管ΔCA的影响

图3所示，各组淋巴管与不同物质孵育，在梯度浓度的SP下，除休克0.5 h淋巴管的ΔCA在SP为3×10－8mol/L时显著高于对照组(P＜0.05)外，其他均未见统计学差异。

Figure 3.Effects of ODQ and/or L－Arg，aminophylline and/or L －NAME on Δcontraction amplitude of lymphatics after hemorrhagic shock.ΔContraction amplitude:the maximal change in contraction amplitude after the administration of SP..n=6.*P ＜0.05 vs control.图3 ODQ和/或L－Arg、AP和/或L－NAME对休克淋巴管ΔCA的影响

4 NO对休克淋巴管ΔFPF的影响

由图4可见，休克0.5 h淋巴管在SP浓度为1×10－8mol/L和3×10－8mol/L时的ΔFPF均显著高于对照组(P＜0.05，P＜0.01);与L－Arg孵育组在1×10－8mol/L、3×10－8mol/L和1×10－7mol/L时均显著低于休克0.5 h组(P＜0.05)，与对照组无显著差异;与L－Arg和ODQ共同孵育的休克0.5 h+LArg+ODQ组淋巴管的ΔFPF在SP浓度为1×10－8mol/L和3×10－8mol/L时显著高于对照组与休克0.5 h+L－Arg组(P＜0.05，P＜0.01)。

休克2 h淋巴管的ΔFPF与对照组比较，差异无统计学意义;在SP浓度为1×10－8mol/L和3×10－8mol/L时，休克2 h淋巴管与 L－NAME孵育后，ΔFPF显著增高(P＜0.01)，且在1×10－8mol/L时高于对照组(P＜0.05);休克2 h淋巴管与 LNAME和AP同时孵育，与对照组相比差异无统计学意义，但SP在1×10－8mol/L和3×10－8mol/L时，显著低于休克2 h+L－NAME组(P＜0.01)。

Figure 4.Effects of ODQ and/or L －Arg，aminophylline and/or L －NAME on Δfractional pump flow of lymphatics after hemorrhagic shock.ΔFractional pump flow:the maximal change in fractional pump flow after the administration of SP..n=6.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs shock 0.5 h;△△P ＜0.01 vs shock 2 h;□P ＜0.05 vs shock 0.5 h+L－Arg;▲▲P＜0.01 vs shock 2 h+L－NAME.图4 ODQ和/或L－Arg、AP和/或L－NAME对休克淋巴管ΔFPF的影响

讨 论

生理状态下，淋巴管内皮细胞仅表达内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)，在淋巴管收缩引起淋巴流的同时，产生剪切力，激活淋巴管内皮细胞中的eNOS，产生并释放NO，瓣膜和管壁都会出现快速、短暂的NO增加，引起淋巴管舒张;随着淋巴管舒张，NO含量减少，引起淋巴管下一步的收缩［12］。在淋巴管收缩过程中，NO几乎随收缩频率的增快成比例增多;当淋巴管收缩减弱时，NO开始减少［13］;可见，NO在正常淋巴管活动的调节中具有重要作用。在炎症、感染、休克、创伤等病理状态下，受多种因素诱导，淋巴管内皮细胞表达诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)显著增加［14］;淋巴管平滑肌细胞也可产生 iNOS［15］，引起NO升高。我室前期的实验也证实了NO与休克后期淋巴管的低收缩性有关。

为了进一步证实NO在休克淋巴管反应性中的作用，在前期工作基础上，我们选择了淋巴管反应性双相变化的2个关键时点:休克0.5 h和休克2 h，制备离体淋巴管条，分别与NO供体L－Arg和NOS抑制剂L－NAME孵育，结果发现，L－Arg可显著降低休克0.5 h淋巴管对多个SP浓度点的ΔCF、ΔTI与ΔFPF;L－NAME均可提高休克2 h淋巴管对多个SP浓度点的ΔCF、ΔTI与ΔFPF，且高于对照组水平。结果提示，NO/NOS途径参与了休克后淋巴管反应性的双相调节。应当指出，L－Arg作为底物在NOS的作用下生成NO，该过程依赖于NOS活性［16］，为了观察NO/NOS的作用，故本文在休克0.5 h采用了NO前体L－Arg，与休克2 h应用NOS抑制剂L－NAME相对应，而未应用直接代谢即可生成NO的供体硝普钠;当然，硝普钠在休克0.5 h时对淋巴管反应性的作用还有待进一步观察。

研究表明，NO通过激活胞内可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylate cyclase，sGC)，使三磷酸鸟苷环化产生环鸟苷酸(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)，增高的cGMP激活cGMP依赖性蛋白激酶G，通过调节淋巴管平滑肌细胞内的Ca2+浓度、Ca2+敏感性，进而调控淋巴管的收缩性［17］。为此，我们选择了cGMP生成的关键酶sGC的抑制剂ODQ(减少cGMP生成)、磷酸二酯酶抑制剂AP(抑制cGMP裂解，增加cGMP浓度，提高胞内Ca2+水平)作为调节cGMP水平的工具药，分别与休克0.5 h+L－Arg、休克2 h+L－NAME孵育，观察对淋巴管反应性的影响。结果发现，在某些SP浓度点上，ODQ可显著抑制L－Arg的作用，使ΔCF、ΔTI和ΔFPF显著高于休克0.5 h+L－Arg组，ΔCF和 ΔFPF高于对照组水平;AP显著抑制 L－NAME的作用，使 ΔCF、ΔTI与ΔFPF均明显低于休克2 h+L－NAME组。结果提示，NO调节休克淋巴管反应性双相变化的机制可能是通过cGMP实现的。

应当指出，SP作用于淋巴管平滑肌细胞，通过Ca2+－钙调蛋白－肌球蛋白轻链激酶通路，增加肌球蛋白轻链20磷酸化水平，使淋巴管收缩，调节生理与休克状态下离体淋巴管的收缩功能［9，18］，故本文应用SP作为评价淋巴管反应性的工具药，观察NO/NOS的作用与机制;至于SP是否参与了NO的调节，还有待进一步观察。同时应该看到，在SP浓度较高(尤其是3×10－7mol/L)时，各组间离体淋巴管反应性多数未出现显著差异，究其原因，可能为:淋巴管反应性除与神经、体液因子以及自身张力多种因素的调节有关外，还与淋巴管本身的结构与物质基础相关，而过高浓度的SP可能掩盖了休克淋巴管结构基础对反应性的影响。

综上，本研究应用离体淋巴管灌流技术，证实了NO参与了休克淋巴管反应性的双相调节，其作用机制可能与cGMP有关;这对于以NO作为药物靶点调控休克淋巴管的收缩性是一个有益的补充。

［1］Zhang J，Liu YK.Changes of mesenteric lymph microcirculation and intestinal lymph circulation during shock in rat［J］.Lymphology，1994，27(Suppl):721 －724.

［2］牛春雨，张 静，穆 铮，等.不同转归的过敏性休克大鼠淋巴微循环的变化［J］.中国病理生理杂志，1997，13(6):620－623.

［3］Gasheva OY，Zawieja DC，Gashev AA.Contraction－initiated NO－dependent lymphatic relaxation:a self－regulatory mechanism in rat thoracic duct［J］.J Physiol，2006，575(Pt 3):821－832.

［4］秦立鹏，牛春雨，赵自刚.一氧化氮在淋巴管收缩中的作用［J］.生理科学进展，2011，42(3):237－240.

［5］秦立鹏，牛春雨，赵自刚，等.一氧化氮对失血性休克大鼠离体淋巴管收缩性双相变化的调节作用［J］.生理学报，2011，63(4):301－309.

［6］刘志权，牛春雨，赵自刚，等.失血性休克大鼠淋巴管对去甲肾上腺素反应性的变化［J］.中国病理生理杂志，2010，26(7):1366－1369.

［7］刘志权，牛春雨，赵自刚，等.失血性休克大鼠淋巴管低反应性的钙敏机制［J］.中国病理生理杂志，2010，26(12):2383－2388.

［8］Davis MJ，Lane MM，Davis AM，et al.Modulation of lymphatic muscle contractility by the neuropeptide substance P［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008，295(2):H587－H597.

［9］秦立鹏，牛春雨，赵自刚，等.P物质增加失血性休克大鼠离体淋巴管的泵功能［J］.中国病理生理杂志，2011，27(7):1323－1328.

［10］Zhang R，Gashev AA，Zawieja DC，et al.Length－dependence of lymphatic phasic contractile activity under isometric and isobaric conditions［J］.Microcirculation，2007，14(6):613－625.

［11］Davis MJ，Davis AM，Ku CW，et al.Myogenic constriction and dilation of isolated lymphatic vessels［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，296(2):H293 －H302.

［12］Kawai Y，Yokoyama Y，Kaidoh M，et al.Shear stressinduced ATP－mediated endothelial constitutive nitric oxide synthase expression in human lymphatic endothelial cells［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2010，298(3):C647－C655.

［13］Bohlen HG，Wang W，Gashev A，et al.Phasic contractions of rat mesenteric lymphatics increase basal and phasic nitric oxide generation in vivo［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，297(4):H1319 － H1328.

［14］Mizuno R，Koller A，Kaley G.Regulation of the vasomotor activity of lymph microvessels by nitric oxide and prostaglandins［J］.Am J Physiol，1998，274(3 Pt 2):R790－R796.

［15］Robertson DA，Hughes GA，Lyles GA.Expression of inducible nitric oxide synthase in cultured smooth muscle cells from rat mesenteric lymphatic vessels［J］.Microcirculation，2004，11(6):503－515.

［16］王露茜，贾 静，郭明发，等.L－精氨酸、氨基胍和胍丁胺在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中的作用［J］.中国病理生理杂志，2011，27(6):1213－1217.

［17］Sauzeau V，Le Jeune H，Cario－Toumaniantz C，et al.Cyclic GMP－dependent protein kinase signaling pathway inhibits RhoA－induced Ca2+sensitization of contraction in vascular smooth muscle［J］.J Biol Chem，2000，275(28):21722－21729.

［18］Wang W，Nepiyushchikh Z，Zawieja DC，et al.Inhibition of myosin light chain phosphorylation decreases rat mesenteric lymphatic contractile activity［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，297(2):H726 － H734.