氯化血红素对全脑缺血/再灌注大鼠海马CA1区神经元凋亡和caspase-3表达的影响

刘 杰，郭新庆，刘辉琦，刘瑞欣，庞明泉，吴 穹

(1青海大学医学院病理生理教研室，西宁 810001;2山东荷泽医学专科学校;3青海大学医学院2008级临床本科班)

脑缺血再灌注损伤(I/R)是指脑缺血致脑细胞损伤，恢复血液再灌注后其缺血性损伤反而进一步加重的现象。海马是脑组织边缘系统的重要组成部分，CA1区神经元对缺血缺氧性损伤高度敏感，缺血缺氧后大量神经元死亡，其中细胞凋亡明显。研究发现，氯化血红素(Hemin)，即含铁原卟啉IX，不仅用于治疗贫血，且对缺血缺氧性器官损伤具有一定的保护作用［1，2］。2011 年 5 月 ～2012 年 1 月，我们观察了不同条件下Hemin给药对大鼠 I/R海马CA1区神经元凋亡和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3表达的影响，报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性Wistar大鼠138只，清洁级，由兰州大学医学院实验动物中心提供(在我院实验室饲养1个月，待大鼠体质量至280～330 g后开始实验)。将138只大鼠随机分为对照组6只，I/R组6只，预防1组～预防15组、治疗1组～治疗6组各6只。药物与试剂:Hemin试剂购于美国Sigma公司，将Hemin配制为浓度60 mg/ml、pH=7.4的溶液;凋亡细胞原位细胞凋亡检测试剂盒购自北京中昊时代生物公司;caspase-3免疫组化染色试剂盒购自武汉博士德生物工程公司。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备及处理 I/R组、各预防组及治疗组采用传统的Pulsinelli四血管闭塞法建立动物全脑缺血模型:10%水合氯醛360 mg/kg腹腔注射全麻、腹卧位固定，充分暴露颈背部，自双耳前缘连线正中为起点向背部做长约1.5 cm的纵行切口，钝性分离，暴露双侧翼状孔，用改制的电凝器快速彻底凝闭双侧椎动脉，术毕大鼠单笼饲养;48 h后动物乙醚吸入麻醉、仰卧固定、1%普鲁卡因局麻，颈前正中纵行切口，钝性分离双侧颈总动脉，动物清醒后用夹闭双侧颈总动脉持续8 min，术后动物单笼喂养3 d。对照组只凝闭双侧椎动脉，预防组在全脑I/R前予Hemin;治疗组给药，按全脑缺血8 min恢复血液再灌注流后予Hemin，见表1。

1.2.2 检测项目 大鼠分组造模后3 d断头处死动物，冰台上迅速取脑，做成厚约4 mm、包含双侧海马组织的冠状切面的脑片，4%多聚甲醛液中固定48 h，严格按步骤进行脱水，浸蜡，包埋，连续5 μm厚连续切片，置于防脱载玻片上。①采用凋亡细胞法原位标记DNA片段检测凋亡细胞，具体步骤参照产品说明书。②采用免疫组化染色(链酶菌抗生物素蛋白过氧化物酶法)检测caspase-3表达。对切片中凋亡细胞标记阳性细胞和免疫组化显色caspase-3阳性的海马CAI区神经元进行计数，采用显微计数法(400×)，随机选取缺血海马5个视野，计算每1 mm2区段内阳性神经元数目。凋亡细胞和caspase-3染色阳性物质均位于细胞核内，胞核呈棕黄色。

表1 各组给药剂量、时间、途径及次数

1.3 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件。数据用表示，单因素方差分析及t检验进行组间比较。检验水准α=0.05。

2 结果

各组凋亡细胞及caspase-3阳性细胞数比较见表2。

3 讨论

脑是“低储备、高供应、高消耗”的器官，脑血流量约占心输出量的15%，脑耗氧量约占总耗氧量的23%，所以脑对缺氧十分敏感［3］。研究发现，I/R引起细胞死亡有坏死和凋亡两种形式，凋亡为主要死亡形式，凋亡细胞的多少决定着梗死面积的大小，对缺血区域神经细胞的挽救在很大程度上依赖于在凋亡前期对凋亡启动环节的遏制［4］。对I/R后神经元凋亡的发生机制，多数学者认为，其既是凋亡相关基因表达的结果，又受许多内外因素(如氧化损伤、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸毒性、炎症反应、相关的细胞因子)的调节。绝大部分细胞凋亡依赖于caspase的存在，caspases-3是凋亡的最终执行蛋白，起着最后枢纽的作用［5］:活化的caspase-3可激活细胞核的DNA酶，切割核小体间的连接，切割细胞核中lamins蛋白，瓦解核结构成核碎片，产生DNA片断，出现核皱缩;分解与细胞骨架构成相关的蛋白，改变部分调控基因的平衡，提高促凋亡基因活性［6］。凋亡细胞法是最常用的检测组织标本凋亡细胞的方法，但结果可能存在假阳性，所以本实验分别用凋亡细胞原位标记法和免疫组化法检测各组大鼠海马CA1区神经细胞凋亡阳性个数和caspase-3表达的变化，反映I/R后海马CA1区神经细胞凋亡程度，并探索Hemin脑神经保护作用的机制。有研究发现，大鼠I/R后caspase-3阳性细胞与凋亡阳性细胞高峰时间基本一致［7］，即I/R后24～48 h达高峰、72 h后开始下降。因此，本实验选择I/R后3 d进行细胞核内凋亡细胞、caspase-3基因阳性表达的检测。

表2 各组凋亡细胞及caspase-3阳性细胞数比较(个)

Hemin是血红素加氧酶-1的底物和促进剂，启动HO/CO系统［8］，抵抗自由基损伤、减少EAA毒性、抗炎、抗凋亡;Hemin可提供合成脑红蛋白(Ngb)所需的血红素和铁，并通过HO/CO-SGC-PKG通路上调Ngb的表达［9］，Ngb在缺血条件下可充当活性氧簇的“清道夫”，限制脂质过氧化反应，阻止神经细胞凋亡［10］。Fago 等［11］发现，Ngb 可能通过快速向Fe3+-CytoC提供1个电子使其还原为Fe2+-CytoC切断凋亡级联反应。张兴毅等［12］发现，大鼠I/R后海马CA1区Ngb的表达可阻止神经细胞凋亡，且与caspase-3呈负相关。因此本实验选用Hemin不同剂量、时间、途径、次数的预防和治疗给药，观察对大鼠I/R海马CA1区神经元凋亡和caspase-3表达的影响，为进一步探讨Hemin的神经保护机制提供实验依据。

司晓云等［13］发现，Hemin灌胃可对体内的HO/CO-胆红素系统起到持续有效的诱导作用，因此本实验采取以灌胃给药的方式为主，未观察动物出现不良反应，并发现灌胃疗效好于腹腔注射。本研究发现，预防组和治疗组凋亡细胞和caspse-3表达阳性细胞数目明显比I/R组减少。Hemin三种不同剂量预防给药对神经细胞的保护作用未呈现剂量依赖性，50、80 mg/kg的抗凋亡作用相近且强于20 mg/kg，推测Hemin 50 mg/kg与80 mg/kg可起到同样的预防作用。本文还发现，Hemin给药时间点不同，减少细胞凋亡作用强弱依次为24 h前、30 min前、48 h前给药，推测可能与Hemin灌胃30 min后即行I/R手术，应激反应使动物胃肠血管收缩，减弱了对Hemin的吸收有关。Hemin多次预防给药效果好于单次给药，并出现剂量依赖性，可能与药物的蓄积有关。但在Hemin治疗用药研究结果发现，I/R后3、6 h两次用药与I/R后即刻一次给药对海马CA1区锥体细胞均有治疗作用且疗效接近，推测在全脑缺血后的有效时间内尽早治疗效果较好。在本研究中还发现Hemin 20 mg/kg单次预防给药与单次治疗给药，凋亡细胞和caspse-3表达阳性细胞数目无显著性差异，但Hemin 20 mg/kg 3次预防给药效果好于I/R后单次和2次治疗给药，由此进一步推测选择Hemin在I/R前多次预防给药、全脑缺血后Hemin尽早治疗给药，对大鼠海马CA1区或会有较好的神经保护作用。

研究结果提示，Hemin在脑缺血前后的有效时间内应用对海马CA1区神经均有保护作用，其机制可能为抑制caspase-3表达，减少细胞凋亡。

［1］Lakkisto P，Caonka C，Fedor C，et al.The Heme oxygenase-1 inducer hemin protects against cardiac dysfunction and ventricular fibirillation in ischaemic/reperfused rat hearts:role of connexin 43［J］.Scand J Clin Lnvest，2009，69(2):209-218.

［2］Zhang B，Wei X，Cui X，et al.Effects of heme oxygenase-l on brain edema and neurologic outcome after cardionpulmonary resuscitation in rats［J］.Anesthesiology，2008，109(2):260-268.

［3］唐朝枢.病理生理学［M］.2版.北京:北京大学医学出版社，2009:77.

［4］Li YH，Gong PL.Neuroprotective effects of dauricine against apoptosis induced by transient focal cerebral ischaemia in rats via a mitochondrial pathway［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2007，34(3):177-184.

［5］Park HJ，Kim YJ，Leem K，et al.Coptis japonica root extract induces apoptosis through caspase3 activation in SNU-668 human gastric cancer cells［J］.Phytother Res，2005，19(3):189-192.

［6］贾士奇，王军，张红霞，等.生姜对局灶性脑缺血大鼠海马神经细胞凋亡及相关蛋白表达的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17(3):164-166.

［7］李建生，任小巧，刘珂，等.老龄大鼠脑缺血再灌注神经细胞凋亡、Bcl-2、Bax表达和caspase-3活性变化［J］.中国病理生理学杂志，2005，21(10):2009.

［8］Ryter SW，Otterbein LE.Carbon monoxide in biology and medicine［J］.Bioessays，2004，26(3):270-280.

［9］Zhang B，Wei X，Cui X，et al.Effects of heme oxygenase-l on brain edema and neurologic outcome after cardionpulmonary resuscitation in rats［J］.Anesthesiology，2008，109(2):260-268.

［10］Li RC，Guo SZ，Lee SK，et al.Neuroglobin protects neurons against oxidative stress in global ischemia［J］.Cereb Blood Flow Metab，2010，30(11):1874-1878.

［11］Fago A，Mathews AJ，Brittain T.A role for neuroglobin:resetting the trigger level for apoptosis in neuronal and retinal cells［J］.Iubmb Life，2008，60(6):398-401

［12］张兴毅，陈长林，李慧仙.大鼠全脑缺血再灌注后脑红蛋白的表达［J］.实用心脑肺血管病杂志，2010，18(2):103-105.

［13］司晓云，程友琴，李小鹰，等.经胃肠道给予氯化血红素对压力负荷性心衰大鼠氧化应激状态的影响［J］.中华老年多器官疾病杂志，2010，9(3):268-271.