小鼠mdm2的表达及活性鉴定

王晓杜，赵阿勇，邓绪芳，马志永

(1.浙江农林大学 林业与生物技术学院，浙江 临安311300；2.中国农业科学院 上海兽医研究所，上海200241)

p53(肿瘤抑制因子)是细胞内信号转导网络中最重要的分子，它在细胞周期调控、DNA损伤修复、细胞衰老、细胞凋亡等方面具有重要功能，是最重要的肿瘤抑制因子[1]。p53作为转录激活因子，其活性受到自身修饰的影响，包括磷酸化、泛素化、乙酰化、甲酰化等[2]。mdm2(murine double minute 2，鼠双微体基因-2)作为其主要的泛素化分子，主要功能是调节p53的泛素化和抑制p53转录活性。mdm2分子是一个调节p53泛素化的E3泛素化连接酶[3]。它是由1 476 bp编码的，由491个氨基酸残基组成的蛋白质，其结构包括p53绑定域、锌指结构域、RING结构域、核定位和核输出序列等不同功能域，在调节p53活性方面发挥重要作用[4]。mdm2调节p53活性表现在2个方面:一是增加p53蛋白泛素化以减少其稳定性；二是通过与p53绑定抑制转录活性[5]。细胞内恒量水平的p53发挥维持细胞稳态的作用，而当发生应激时，p53水平明显升高，细胞为了防止其过分升高，建立起了一套调节p53活性的精巧机制，从而使细胞生存下去，mdm2就是这个过程中的主要负性调节因子之一[4]。因此，研究在应激条件下p53的功能，了解p53活性变化机制，建立一个mdm2抑制p53活性的细胞模型是十分重要的手段之一。本研究拟克隆小鼠Mus musculus的mdm2 cDNA，构建重组真核表达载体，并在哺乳动物细胞中表达，验证该蛋白的E3连接酶活性和抑制p53活性的能力，建立mdm2抑制p53活性的细胞模型，为研究mdm2活性、mdm2与p53之间的相互作用和mdm2对p53活性调节等相关研究提供技术手段。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠3T3，H1299细胞株购于中国科学院上海细胞保藏中心。

质粒:p3xFLAG-CMV-7.1，pEGFP-N1-p53由浙江农林大学林业与生物技术学院实验室保存。

常用的酶和试剂:AMV(avian myelobastosis virus，禽骨髓母细胞瘤病毒)反转录酶、PCR(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)扩增用Taq酶购自宝生物公司；lipofectamine 2 000转染试剂购于Invitrogen公司；DMEM (Dulbecco’s modified eagle edium)和胎牛血清购于Gibco公司；ECL(ekectrochemiluminescens)发光试剂盒和BCA (bicinchoninic acid)试剂盒购于Pierce公司；质粒DNA中提试剂盒购于Nucleobond AX公司；Promega’s Steady-GloR萤光素酶检测试剂盒购于Promega公司。

各种抗体:小鼠抗p53单克隆抗体(Do-1)，小鼠抗mdm2(SMP-14)，小鼠抗FLAG，小鼠抗GFP(green fluorescent protein，绿色荧光蛋白融合单链抗体)，小鼠抗β-actin抗体，HRP(horseradish peroxidase，辣根过氧化物酶)标记的羊抗小鼠IgG，HRP标记的羊抗兔IgG，TFITC(fluorescein isothiocyanate，异硫氰酸荧光素)标记的羊抗小鼠IgG等抗体购于Santa Cruz公司。

其他试剂采用国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆及重组质粒的构建 刮取单层培养的小鼠3T3细胞样品后，采用Trizol试剂盒提取细胞总核糖核酸(RNA)，利用olig(d)T作为反转录引物合成cDNA。以此cDNA为模板，利用引物(Forward:5′-TCTGAATTCGATGTGCAATACCAAC-3′，Reverse: 5′-GCGGTCGACCTAGTTGAAGTAAGTT-3′) 进 行PCR扩增mdm2基因的全长编码区。PCR程序为:94℃5 min；94℃40 s，56℃40 s，72℃ 2min，运行35个循环；72℃10 min；10℃5 min。PCR产物分别用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后，与相应的双酶切p3xFLAG-CMV-7.1载体相连接，转化大肠埃希菌Escherichia coli DH5α。挑取单菌落扩大培养，然后分别用菌落PCR和质粒酶切鉴定阳性克隆，并将阳性克隆送去上海英骏生物公司进行DNA测序。结果表明:获得mdm2的重组真核表达载体p3xFLAG-CMV-7.1-mdm2。

1.2.2 细胞转染与蛋白免疫印迹(Western blotting) 真核表达质粒(p3xFLAG-CMV-7.1-mdm2和pEGFPN1-p53等)转染细胞:取质粒2.0 g和2.0 L脂质体在200.0 L无血清培养基中混匀，室温作用20 min；在六孔板中单层培养的H1299细胞长满后，去掉培养液，PBS(phosphate buffer solution，磷酸盐缓冲溶液)洗涤2次，然后，加入真核表达质粒和脂质体混合液，在37℃培养4～6 h后更换完全培养基，继续培养24 h，然后按照下面方法收集各种细胞样品。

培养细胞样品的制备:去掉培养液，PBS洗涤2次，然后加1.0 mL PBS，用细胞刮铲刮下细胞，收集细胞放入1.5 mL EP(epoxy epoxide，环氧树脂)管中，4℃3 000 r°min－1离心5 min，小心去掉上清，－70℃保存或进行下一步操作。收集的细胞加入适量的裂解液，冰上裂解5 min，超声裂解1～2 s，煮沸5 min，4℃离心10 min，转移上清至新的EP管中。取2.0 L用BCA试剂盒测定总蛋白浓度，加5×上样缓冲溶液煮沸5 min，4℃高速离心10 min，取上清－20℃储存。SDS-PAGE(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶)电泳和转印:按照分子克隆实验指南上的方法进行SDSPAGE，上样30.0 μg°样品－1，同时采用彩色预染蛋白质标记(marker)作为指示。电泳完成后，卸下凝胶浸泡在转印缓冲液中，剪下与胶同样大小的NC(nitrocellulose filter membrance，硝酸纤维素膜)膜和滤纸，在转印缓冲液浸泡15～20 min。按照从负极到正极先滤纸—胶—NC膜—滤纸安装好三明治夹心后，放在全湿转印槽中，65 V恒压转印2～3 h。封闭、一抗及二抗处理:转印完毕后，取下NC膜，放在50.0 g°L－1脱脂乳的 TBST(tris-buffered saline Tween-20)溶液(封闭液)中封闭 2 h，用含有 2.0 g°L－1Tween-20 的Tris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液(TBST洗涤缓冲液)洗涤2次(5 min°次－1)。加入1∶4 000稀释的一抗(小鼠抗p53，小鼠抗FLAG，小鼠抗GFP，小鼠抗mdm2等)，4℃过夜轻摇振荡。回收一抗后，NC膜用TBST洗涤3次，加入带有HRP标记的羊抗小鼠二抗 (1:10 000稀释)，室温反应1 h，TBST洗涤5次。显色:显色利用ECL发光试剂盒在暗室中进行。试剂盒中A液和B液等体积混合后，滴在上述NC膜上，轻微摇动混匀5 min，放入暗盒中，然后压上X光胶片，根据亮度确定曝光时间。曝光完成后，在显影液中显影待条带出现后，放入定影液中定影2～3 min。胶片洗涤晾干后标记蛋白质标记，扫描胶片并进行剪辑。转印(reblotting):上述显完色的膜，加入5.0 mL脱膜缓冲液(reblotting buffer)或Stripping 缓冲液(100 mmol β-mercapto-ethanol，20.0 g°kg－1SDS，62.5 mmol Tris-Cl pH 6.8)，55 ℃反应 30 min，TBST洗涤2次后，加入封闭液，然后按照上述过程，更换一抗和二抗，可以进行第2次显色。

1.2.3 间接免疫荧光染色 在盖玻片上培养H1299细胞，转染2.0 g的质粒24 h后，体积分数为4%甲醛 ∶体积分数为10%甲醇(1∶1)混合液固定30 min，PBS洗涤3次，37℃下用体积分数为1%NP40(乙基苯基聚乙二醇)处理30 min，PBS洗涤3次，100.0 g°L－1山羊血清37℃封闭30 min，PBS洗涤3次，1∶100比例稀释的一抗(小鼠抗FLAG抗体)37℃孵育30 min，PBS洗涤3次，羊抗小鼠FITC标记的二抗(1∶500)37℃孵育30 min，TBS洗涤3次，DAPI室温染色10 min，封片剂封片，荧光显微镜下观察目的蛋白表达和亚细胞定位情况。

1.2.4 荧光素酶活性测定 各种试验质粒(pEGFP-N1-p53，p3xFLAG-CMV7.1-mdm2)和p53荧光素酶报告基因质粒(p53-Luc)，Rinna质粒(pRL-TK)，采用脂质体方法在H1299细胞上进行共转染，24 h后收集细胞样品，然后按照Promega公司双荧光素酶报告系统检测试剂盒的方法，在Modulus多功能检测仪上检测p53的相对荧光素酶活性，对获得数据进行t检验等统计分析。

2 结果与分析

2.1 小鼠mdm2基因的克隆

由于在小鼠3T3细胞中，mdm2的mRNA表达很多，所以本试验以该细胞为材料，提取其总RNA，反转录为cDNA，再以cDNA为模板，以1.1.1中的引物，PCR扩增获得大约1 500 bp的片段(图1)，以BamHⅠ和SalⅠ双酶切，把片段亚克隆到p3xFLAG-CMV-7.1真核表达载体上，酶切和测序结果表明:重组真核表达质粒p3xFLAG-CMV-7.1-mdm2构建成功(图1)。所得序列经过NCBI(美国国家生物技术信息中心)上的Blast软件比对，结果表明:本实验所得到mdm2核苷酸序列与NCBI公布的小鼠 mdm2序列(NM_010786)100%同源。

图1 重组表达质粒p3xFLAG-CMV7.1-mdm2的构建Figure 1 Construction of recombinant plasmid p3xFLAG-CMV7.1-mdm2

2.2 小鼠mdm2蛋白真核表达

重组真核表达质粒p3xFLAG-CMV7.1-mdm2和pEGFP-N1-p53转染H1299细胞，采用蛋白免疫印迹(Western blotting)和间接免疫荧光方法检测mdm2的表达和亚细胞定位，分别采用FLAG-vector(p3x-FLAG-CMV-7.1)，GFP-vector(pEGFP-N1)作为阴性对照，空载体FLAG-vector表达的FLAG片段太小无法检测到，而GEP-vector能表达大约27 kDa蛋白。实验结果表明:在Western-blotting试验中，用抗FLAG抗体检测FLAG-mdm2，在发现大约60 kDa有一条特异条带(图2)，抗p53(Do-1)抗体检测GFP-p53，发现一条大约80 kDa处的特异性条带 (GFP＋p53大小为79 kDa)。本试验以GFP-p53蛋白表达作为对照，mdm2蛋白大小与文献报道基本一致[3]。间接免疫荧光检测中，利用小鼠抗FLAG抗体为一抗检测FLAG-mdm2表达和定位，DAPI染细胞核。结果表明:mdm2主要在细胞核中表达(图3)。mdm2蛋白具有核定位序列，这种细胞核定位可能与其绑定和调节p53活性的生理功能密切相关。

2.3 小鼠mdm2蛋白提高p53泛素化水平

mdm2作为E3连接酶，其主要功能体现在促进p53蛋白的泛素化，从而促进p53的降解，所以p53泛素化水平变化是衡量mdm2活性的重要手段。本试验把p3xFLAG-CMV-7.1-mdm2和pEGFPN1-p53质粒按照一定量的比例转染H1299细胞，转染 8 h后添加泛素化酶抑制剂 MG132(10.0 g°mL－1)，18 h 后收集细胞样品，以小鼠抗 p53(Do-1)抗体为一抗，Western blotting检测p53泛素化水平。结果表明:在阴性对照中，p53泛素化水平几乎没有变化，这可能与mdm2在正常细胞中表达量低有关，而转染表达mdm2细胞中，不但mdm2表达量较大，p53的泛素化水平也得到提高(图4)。并且随着mdm2表达量的增加，p53泛素化水平逐步增加，表明p53的泛素化对mdm2的表达水平表现出一定的依赖性。

图2 Western blotting检测FLAG-mdm2的表达Figure 2 Expression of recombinant protein FLAG-mdm2 detected by Western blotting

图3 间接免疫荧光检测FLAG-mdm2的表达和亚细胞定位Figure 3 Subcellular localization and expression of FLAG-mdm2 indicated by indirect immunofluorescence

2.4 小鼠mdm2蛋白抑制p53转录活性

mdm2的另一功能是抑制p53蛋白的转录活性，那么采用p53报告基因系统可以检测mdm2调节p53活性的变化，从而判断mdm2是否具有活性。本试验把FLAG-vector(p3xFLAG-CMV-7.1)，GFP-vector(pEGFP-N1)，pEGFP-N1-p53，p3xFLAG-CMV7.1-mdm2，p53-Luc和内参质粒pRL-TK按照一定比例转染H1299细胞，收集细胞样品后，利用Promega公司的试剂盒检测p53的相对转录活性，结果表明在无mdm2表达时，p53蛋白的转录活性较高，在有mdm2蛋白表达时，p53的转录活性较低(图5)，验证了mdm2对p53转录活性的抑制作用。因此，也证明我们克隆表达的鼠mdm2具有完整的生物学功能，建立了mdm2蛋白抑制p53活性的细胞模型。

3 讨论

mdm2在细胞稳态调节中发挥重要作用，正是它的负向调节作用，控制了p53活性过高而损伤细胞。在人类肿瘤疾病中，7%是由于mdm2的过表达造成的，而且在mdm2启动子的309位SNP(single-nucleotide polymorphism)能导致mdm2转录水平增加，从而导致该人群患肿瘤的几率增加[6]。p53蛋白作为转录因子又能促进mdm2的转录和表达，形成一个负反馈调节环[7]。外界因素刺激机体或细胞可以改变它们之间的这种调节机制，打破该平衡之后果就是导致肿瘤的发生或疾病的蔓延与恶化[8]。因此，mdm2可以作为肿瘤治疗的靶标，Nutlin 3a[9]，HLI98[10]是与 mdm2 结合的小分子，能够干扰p53和mdm2之间的相互作用，具有治疗肿瘤疾病潜在药物的可能。病原微生物也能打破这种平衡，从而使其能够逃逸机体的先天性免疫机能。如呼吸道合胞病毒[11]、人巨细胞病毒[12]、 流感病毒[13]等病毒能通过干扰 mdm2 和 p53 之间的相互作用调节p53活性，使p53的活性增加，进而使病毒复制免受机体先天性免疫机制的影响。

本研究从小鼠的3T3细胞中克隆了小鼠mdm2 cDNA，并把该基因编码区亚克隆到真核表达质粒上，使重组FLAG-mdm2蛋白在哺乳动物细胞中得以表达，利用间接免疫荧光的方法观测了重组蛋白的亚定位，发现mdm2主要定位在细胞核内，这可能与其参与p53活性调节的功能密切相关。mdm2的活性主要体现在提高p53泛素化水平和抑制p53转录活性[5]。本研究使mdm2和p53共表达，通过检测p53的泛素化水平，发现mdm2能明显提高p53泛素化水平，两者之间具有一定的剂量依赖性。本文还利用报告基因系统验证了mdm2抑制p53相对荧光素酶活性，从而证明本实验成功构建了mdm2抑制p53活性的细胞模型。此模型，将为进一步研究mdm2活性和功能、mdm2与p53相互作用、p53活性位点突变等与p53活性调节的研究提供了工具，同时也为今后研究微生物因子干扰mdm2和p53相互作用，逃逸p53的抗病毒作用[14]和机体先天性免疫[15]相关研究提供了技术手段，为今后开展抗肿瘤药物筛选、病毒致病机理等研究提供基础。

图4 FLAG-mdm2调节p53多泛素化Figure 4 Polyubiquitination of p53 in p3xFLAG-CMV-7.1-mdm2 transfected cells

图5 mdm2抑制p53的转录活性Figure 5 Inhibitory effect of mdm2 on p53-mediated transcriptional activity by luciferase assay

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