墨天牛性信息素研究进展和研究方法

匡先钜，钱明惠，黄焕华，黄咏槐，范军祥，沈木胜

(广东省林业科学院，广东广州 510520)

墨天牛属Monochamus Geyer属鞘翅目Coleoptera多食亚目Polyphaga叶甲总科Chrysomeloidea天牛科 Cerambycidae 沟胫天牛亚科 Lamiinea［1］。由于多种墨天牛是松材线虫Bursaphelenchus xylophilus的媒介昆虫，松墨天牛Monochamus alternatus和樟子松墨天牛M．galloprovincialis Olivier等墨天牛属昆虫已成为多个国际植物保护和检疫组织的重要检疫对象［2］。

目前，国内外对墨天牛生物学、生态学特性，发生规律以及防治方法进行了比较深入的研究。随着研究的深入，人们逐步认识到调节昆虫行为活动的信息化学物质在害虫治理中的应用潜力和广阔前景，墨天牛性信息素和性引诱剂的研发越来越受到关注。作者综述了墨天牛属性信息素研究进展以及研究方法，以期为研发我国松材线虫病的主要媒介昆虫松墨天牛引诱剂提供依据，同时为其它昆虫性信息素的研究提供参考。

1 墨天牛性信息素研究进展

天牛存在性引诱现象最早是Linsley于1959年报道的，他发现马来西亚花天牛亚科某些种类受限制的雌成虫能引诱飞翔中的雄成虫。但直到20世纪70年代，人们才发现了天牛性信息素的存在。

1.1 天牛性信息素的种类 昆虫性信息素属于种内信息素，是由同种昆虫的某一性别个体的特殊分泌器官分泌于体外，能被同种异性个体的嗅感器接受，并引起异性个体产生一定行为反应或生理效应(如觅偶、定向求偶、交配等)的微量化学物质［3-4］。从性信息素作用范围的角度，天牛性信息素可分为长距离性信息素(long range sex pheromone)、短距离性信息素(short range sex pheromone)和通过雌雄成虫接触才能导致性识别的接触性信息素(contact sex pheromone)［5］。

1.2 樟子松墨天牛性信息素的研究进展 松材线虫病的欧洲媒介昆虫樟子松墨天牛的性信息素研究已经取得突破性进展。Ibeas等通过观察樟子松墨天牛交配行为发现雄虫紧紧抱住雌虫后，用下颚须和下唇须舔舐其鞘翅后才交配。推测樟子松墨天牛雌虫体表存在接触性信息素;樟子松墨天牛“Y”型嗅觉仪性引诱的性行为学结果显示达到性成熟的雄虫能释放短距离性信息素［6］。Ibeas等用固相微萃取法SPME和溶剂萃取(solvent extraction)2种方法分析了樟子松墨天牛的性信息素，发现雌雄虫表皮成分种类差异不大，只存在比例的差别［7］。Pajares等通过气质联机对触角电位反应相对应保留时间的气相色谱化合物进行结构鉴定，首次鉴定出1种由雄性产生的性信息素，2-十一烷氧基-1-乙醇(2-undecyloxy-1-ethanol)，进一步生物测定实验证明此化合物对成熟雌虫有明显的吸引作用，可作为诱杀樟子松墨天牛的性引诱剂［8］。

1.3 松墨天牛性信息素研究进展 关于松墨天牛性信息素，不同学者的研究结果并不一致。Okamoto认为松墨天牛两性个体可被植物的挥发性化学物质吸引而聚集到寄主植物上，雄虫通过触角触探雌虫体表接触性信息素而识别异性个体［9］。Hanks野外观察显示，松墨天牛雌、雄成虫通过寄主引诱聚集后，存在雄虫触角接触雌虫来完成择偶的行为［10］，暗示触觉感受在择偶过程中有较重要作用。樊建庭等推测松墨天牛不存在雌性接触性信息素，主要是通过视觉找到配偶，完成交配过程［11］。一些学者则认为松墨天牛产生长距离信息素，如Fauziah等通过室内和林间试验，提出松墨天牛雄虫释放长距离信息素吸引雌虫，近距离时通过触角识别雌虫体表的接触性信息素进而产生一系列性行为［12］;Kim等认为，松墨天牛交配行为分为2个阶段:1)雌虫受雄虫挥发性信息素的吸引;2)雄虫用触角感受雌虫体表的接触性信息素后发生交配行为［13］。Teale等用樟子松墨天牛的性信息素2-十一烷氧基-1-乙醇在福建林间诱捕到了松墨天牛的雌虫和雄虫，进一步研究证明松墨天牛雄虫也能产生2-十一烷氧基 -1-乙醇，而雌虫则不能［14］。

2 墨天牛性信息素的研究方法

墨天牛性信息素的研究步骤为:1)性行为学观察和引诱实验推测天牛是否存在性信息素及其类型;2)利用吸附法或萃取法提取天牛身上的气味物质;3)通过气相色谱与触角电位联用(GC-EAD)技术确定松墨天牛触角有反应的保留时间，用气质联机对触角电位反应相对应保留时间的气相色谱化合物进行分子结构鉴定;4)如果鉴定结果为已知商品化的化合物，则用标样化合物对鉴定结果做进一步确认;如果鉴定结果为未商品化的化合物，则合成该化合物，用合成的化合物标样对气质联机鉴定结果做进一步确认;5)采用风洞实验或田间实验方法用松墨天牛成虫对性信息素进行生物测定。

2.1 墨天牛性信息素种类的确定

2.1.1 接触性信息素测定 为了测试樟子松墨天牛交配识别中雌虫是否存在接触性信息素，Ibeas等［7］参考其它天牛种类确定接触性信息素的方法设计了以下实验:1)将1头樟子松墨天牛雌虫置于-40℃冷冻致死，再置于室温1 h恢复温度，然后在旁边放1头雄虫。如果雄虫用唇或上颚吻雌虫的背板后，弯曲身体试图与其交配，则记录1次正反应。如果雄虫用唇接触雌虫后没有想要与其交配，则记录1次负反应。2)利用正己烷萃取同一头雌虫。萃取液保存在-40℃待用。被正己烷清洗过的雌虫风干后放在相同的雄虫前，雄虫对正己烷清洗过的雌虫不再有反应。3)滴加0.1雌虫当量(female equivalents)的浓缩萃取物(200 μL)到相同的雌虫的背板上，风干后将该雌虫放到同一头雄虫面前，如果雄虫没有反应，继续滴加0.1雌虫当量的萃取液到雌虫背上，并重新测试，直到整头雌虫萃取液的量。如果雄虫对某一浓度做出了反应，则不再对它进行下个更高浓度的测试。在每个测试间隔利用丙酮清洗台面并且风干。

结果发现雄性天牛与冷冻杀死的雌性天牛交配，而不与正己烷清洗过的雌性天牛交配;当萃取液重新滴加到雌天牛身上后，雄天牛又会与它交配。证实了雌性天牛鞘翅上存在接触性信息素［7］。然而樊建庭等利用相似的方法发现松墨天牛雌虫并不存在接触性信息素［11］。

2.1.2 短距离性信息素测定 樟子松墨天牛短距离性信息素的测定方法如下:按触角长度将新羽化的雌雄天牛分开，按日龄将生测管内的天牛分为成熟(＞15日龄)和未成熟(0到3日龄)2组。利用成熟的雌雄虫、未成熟的雌雄虫和地中海松Pinus halepensis枝条做气味源，成熟的雌雄虫或未成熟的雌雄虫作为测试天牛。在玻璃Y形嗅觉仪(直径4 cm，主管长24 cm，臂长22 cm，两臂夹角70°)主管口处释放供试天牛，让其向上爬行选择任意含有气味刺激的管。当测试天牛到达管臂口时，测试结束，记录选择结果。

结果表明，雌虫会被雄虫产生的气味物质引诱，但不被雌虫产生的气味物质吸引。然而，未成熟的雄虫不能被成熟雌虫释放的引诱性信息素吸引并且未成熟的雌虫也不被成熟雄虫吸引，证明只有成熟雄虫才产生短距离性信息素［6］。

2.1.3 长距离性信息素测定 为了测试梣红天牛Neoclytus acuminatus(F.)是否存在长距离性信息素，Lacey等［15］在植物园做了野外笼生测实验。实验将3个中间间隔2 m的铝屏风笼(aluminum screen cages，60 cm ×60 cm ×20 cm)置于 20 m 外刚伐下的至少有40头天牛成虫的红白腊木Fraxinus pennsylvanica的枝条的上风口。每个笼内装4根刚砍下来的朴树Celtis occidentalis圆木。其中1个笼同时装6条梣红天牛雄虫，第2个笼装6条雌虫，第3个笼只装朴树圆木。每小时检查1次笼子并且记录停留在笼子上面的梣红天牛的数量。

实验结果显示同时装有圆木和梣红天牛雄虫的笼子诱到了32头天牛，装有圆木和梣红天牛雌虫的笼子诱到了5头天牛，只装有圆木的笼子诱到了2头天牛，3个笼所诱到的天牛数量差异极显著。证实雄虫产生了性信息素［15］。墨天牛长距离性信息素的测定可参考此方法。

2.2 性信息素的提取方法

墨天牛气味物质的提取有多种方法，目前用的较多的方法有正己烷溶剂萃取法、固相微萃取法、Porapak Q吸附法等。

2.2.1 溶剂萃取 将天牛放在-20℃冰冻致死后，置于室温30～60 min。将天牛放入干净的装有GC-grade正己烷的玻璃小瓶(直径2～4 cm)中洗涤2 min，每瓶1头。利用氦气将萃取物浓缩，并且将1～2 μL的浓缩液体注入气相色谱中［7］。

2.2.2 固相微萃取 将1个固相微萃取fiber holder和1个100 μm的聚二甲硅氧烷外围的滤网(Supelco/Sigma-Aldrich，Madrid，Spain)在气相色谱注射器中(250℃)清洗5 min。抓住昆虫的腿并且用固相微萃取纤维轻轻刮昆虫的背部30 s。然后将纤维放入注射器中，再开始气相色谱分析［7］。

2.2.3 Porapak Q吸附法 将天牛放入烧瓶中，里面的空气通过活性碳以2 L/min的速度过滤抽出(10 cm ×2 cm;10～18目;Fisher Scientific，Loughborough，Leicestershire，UK)，挥发物被吸附在 Pasteur移液管的玻璃木塞内(直径4 mm)的Porapak Q上(50～80目;200 mg;Supelco，Gillingham，Dorset，UK)。收集到的挥发物用二氯甲烷(3 mL×0.5 mL)从滤网上洗涤下来并且直接用来分析［8］。

2.3 性信息素的分析和鉴定

2.3.1 松墨天牛嗅感器扫描 对松墨天牛的触角感器进行扫描观察发现，松墨天牛触角上共有7种感器，即毛形感器、锥形感器、指形感器等，触角不同节和不同亚节上嗅觉感器的种类及数量分布存在明显差异［16］。触角不同节和不同亚节对气味物质的触角电位反应也存在差异［17］。

2.3.2 松墨天牛触角电位反应 由于松墨天牛触角较长，难以将整个触角固定到电极上用于天牛气味物质的触角电位反应的测定，而且气流也难以均匀刺激到整个触角上的所有感受器。因此，在性信息素分析的实验中，应该截取1段天牛触角中含性信息素感受器丰富的部位用于实验［16］。

2.3.3 气味物质的气相色谱和触角电位GC-EAG分析 利用1个HP 6890装置(Agilent Technologies，Stockport，Cheshire，UK)与 1 个极性 Supelco Wax 10(Supelco，Gillingham，Dorset，UK) 和 1 个非极性SPBS(Supelco)包裹的二氧化硅毛细管圆柱(长30 m，直径 0.32 mm，膜厚 0.25 μm)配合。2个圆柱端口与1个含推入式Y管的去活化二氧化硅管融合。Y管出口一端与火焰离子探测器(FID)相连做气相色谱(GC)分析。另一端导出到1个硅烷化的玻璃T管(臂长5 cm，直径4 mm)，T管的1个柄与1个供氮装置(200 mL/min，每供氮3 s后间隔17 s)相连。T管的第3个柄通过GC烤箱壁到昆虫的EAG准备阶段中。EAG由1个手提式由综合电焊钳，显微操纵器，和1个放大器组成的装置(INR-02;Syntech，Hilversum，The Netherlands)记录［8］。

2.3.4 气味物质的气质联机GC-MS分子结构鉴定 收集的气味在1个有Supelco Wax 10极包围的由二氧化硅毛细管圆柱融合的流注射器和配套的HP 6850(Agilent Technologies)装置上进行气相色谱分析，同时也由1个HP 6890与1个HP 5973MS(Agilent Technologies)配套在EI模式进行GC-MS分析。GC保留时间与以n-alkanes的保留时间比较转换为保留指数(RI)。组分通过质谱与质谱数据库(NIST 05 Mass Spectral Library;Agilent Technologies)比较和进一步的质谱与合成水平的GC保留时间比较，从而确定性信息素的分子结构［8］。

2.4 性信息素的合成 目前市场上应用较多的信息素是通过化学合成获得，根据昆虫信息素结构特点，选择原料易得、条件适宜、产率高的合成路线，合成所需目标产物、衍生物及其各种异构体［3］。

樟子松墨天牛的信息素2-十一烷氧基-1-乙醇的合成步骤如下:在干燥的二甲基甲酰胺中滴加氢化钠到乙二醇溶液中，然后在60℃加热30 min后，冷却到室温，逐滴滴加1-bromoun-decane。混合物在室温下搅拌2 h，然后在60℃放置2 h，1-bromoundecane都发生了反应后，混合物用含20%乙醚diethylether的石油醚petroleum ether半饱合盐水冷却萃取2次。有机萃取物用硫酸镁干燥并且用硅胶过滤，随后在旋转蒸发器上蒸发，残留物在125℃蒸馏以得到产物［8］。

2.5 性信息素的生物测定

一些研究指出小蠹类的性信息素齿小蠹二烯醇(ipsdienol)、齿小蠹烯醇(ipsenol)和(S)-顺马鞭草烯醇((S)-cis-Verbenol)对多种墨天牛属天牛具有引诱作用，而且与以松树气味物质 α-蒎烯(α-pinene)为主要成分的植物源引诱剂混合使用在林间具有增效作用［18］。为了测定性信息素是否具有引诱天牛的效果，可以通过风洞试验或田间试验对性信息素进行生物测定。

2.5.1 风洞试验生物测定 风洞试验参考王新花等的风洞选择实验。风洞仪为1.5 m×0.4 m×0.4 m的有机玻璃箱，以变速电扇从左侧通过纱布吹人空气并将洞内风速控制在0.3 m/s［19］，将引诱剂置于风洞进风口处，观察墨天牛对引诱剂是否有选择行为。结果表明，双条杉天牛会被引诱剂吸引。2.5.2 田间试验生物测定 Pajares等在地中海松林中利用不同浓度的合成性信息素2-十一烷氧基-1-乙醇测定了松墨天牛的诱捕效果，并且调查了它与利它素化合物α-蒎烯、齿小蠹烯醇和齿小蠹二烯醇等多个组合混用的诱捕情况。结果表明，含有2-十一烷氧基-1-乙醇的诱捕器都诱捕到了雌雄樟子松墨天牛，且浓度越高，诱捕量越大;这一组分同时对利它素混合物的聚集作用起到了增效作用，它们的混合物的诱虫量比单独使用这两种物质做引诱剂所诱集到天牛的总和多80% ～140%［8］，证明了2-十一烷氧基-1-乙醇对樟子松墨天牛具有很好的诱集效果。

3 讨论

目前以松树气味物质α-蒎烯为主要成分的寄主植物源引诱剂在国内已经得到广泛应用，然而植物源引诱剂对产卵期和产卵后的天牛引诱作用比产卵前的天牛活性高，产卵期和产卵后的天牛已经通过产卵前取食和产卵行为将松材线虫侵入健康松树体内，传播了松材线虫病［17］。利用性信息素诱杀害虫有针对性强、效果高、对天敌无害、对环境无污染等优点［20］。如能利用松墨天牛性信息素，或者将信息素与植物源引诱剂复合使用，不但能提高对天牛的诱虫率，还可以引诱到未交配，未产卵的松墨天牛，提早诱杀带线虫的松墨天牛，更有效地抑制松材线虫病的传播蔓延和松墨天牛的危害。

墨天牛作为传播松材线虫的媒介昆虫，其化学通讯的研究受到学者们的高度关注。已经鉴定出樟子松墨天牛的雌雄成虫主要产生接触性性信息素，成熟雄虫可以产生短距离性信息素;松墨天牛被认为不存在接触性性信息素［11］。并且已经鉴定出1种由雄性特异性产生的短距离性信息素的成分为2-十一烷氧基-1-乙醇。然而与鳞翅目昆虫相比，墨天牛化学通讯研究还存在差距。目前鳞翅目昆虫已鉴定出350多种性信息素，同时在嗅觉机制上对气味结合蛋白的研究已取得一定成果，近年来开始在分子水平上进一步探索信息素生物合成激活神经肽(pheromone biosynthesis activating neumpepide，PBAN)的生理功能及其基因表达［21］，对墨天牛的化学生态的研究均有一定的参考价值。相信随着生测、诱捕技术的不断改进以及合成技术、分子生物学的飞速发展，天牛化学通讯的研究将会迈上新的台阶，在害虫综合管理中发挥更大的作用。

［1］ 蒋书楠，蒲富基，华立中.中国经济昆虫志:第35册 天牛科(3)［M］.北京:科学出版社，1985:204.

［2］ 宁眺，方宇凌，汤坚，等.松材线虫及其关键传媒墨天牛的研究进展［J］.昆虫知识，2004，41(2):97-104.

［3］ 范晓军，李瑜，李瑶，等.昆虫性信息素研究进展［J］.安徽农业科学，2010，38(9):4 636-4 638.

［4］ 苏茂文，张钟宁.昆虫信息化学物质的应用进展［J］.昆虫知识，2007，44(4):477-485.

［5］ 王广利，迟德富.天牛化学通讯及其在害虫综合治理中的应用［J］.林业科学，2007，43(9):88-95.

［6］ Ibeas F，Diez J J，Pajares J A.Olfactory sex attraction and mating behaviour in the pine sawyer Monochamus galloprovincialis［J］.J Insect Behav，2008，21:101-110.

［7］ Ibeas F，Gallego D，Diez J J，et al.Female recognition and sexual dimorphism of cuticular hydrocarbons in Monochamus galloprovincialis(Coleoptera:Cerambycidae)［J］.Entomol Soc Am，2009，102(2):317-325.

［8］ Pajares J A，Álvarez G，Ibeas F，et al.Identification and field activity of a male-produced aggregation pheromone in the pine sawyer beetle，Monochamus galloprovincialis［J］.J Chem Ecol，2010，36:570-583.

［9］ Okamoto H.Behavior of the adult of Japanese pine sawyer，Monochamus alternatus Hope［C］//National Science Foundation.Proceedings of United States-Japan seminar:The resistance of pines against pine wilt disease，Washington:1984:82-90.

［10］ Hanks L M.Influence of the larvae host plant on reproductive strategies of cerambycidae beetles［J］.Annu Rev Entomol，1999，44:483-505.

［11］ 樊建庭，韦卫，孙江华.松墨天牛是否存在雌性接触信息素［J］.昆虫知识，2007，44(1):125-129.

［12］ Fauziah B A，Hidaka T，Tabata K.The reproductive behavior of Monochamus alternatus(Coleoptera:Cerambycidae)［J］.Appl Entomol Zool，1987，22:272-285.

［13］ Kim G，Takabayashi J，Takahashi S，et a1.Function of pheromones in mating behavior of the Japanese pine sawyer beetle，Monochamus alternatus Hope［J］.Appl Entomol Zool，1992，27:489-497.

［14］ Teale S A，Wickham J D，Zhang F P，et al.A male-produced aggregation pheromone of Monochamus alternatus(Coleoptera:Cerambycidae)，a major vector of pine wood nematode［J］.J Econ Entomol，2011，104(5):1 592-1 598.

［15］ Lacey E S，Millar J G.，Moreira J A，et al.Male-produced aggregation pheromones of the cerambycid beetles Neoclytus acuminatus acuminatus［J］.J Chem Ecol.2004，30(8):1 493-1 507.

［16］ 王四宝，周弘春，苗雪霞，等.松墨天牛触角感器电镜扫描和触角电位反应［J］，应用生态学报，2005，16(2):317-322.

［17］ Zacharuk R Y.Ultrastructure and function of insect chemosensilla［J］.Annu Rev Entomol，1980，25:27-47.

［18］ Ibeas F，Gallego D，Diez J J，et al.An operative kairomonal lure for managing pine sawyer beetle Monochamus galloprovincialis(Coleoptera:Cerambycidae) ［J］.J Appl Entomol，2007，131(1):13-20.

［19］ 王新花，肖春安，肖云江.双条杉天牛成虫对植物源引诱剂的选择性反应［J］.中国森林病虫，2008，27(3):7-9.

［20］ 周琳，马志卿，冯岗，等.天牛性信息素、引诱植物和植物性引诱剂的研究与应用［J］.昆虫知识，2006，43(4):433-438.

［21］ 王桂荣，郭予元，吴孔明.昆虫触角气味结合蛋白的研究进展［J］.昆虫学报，2002，45(1):131-137.