三磷酸腺苷结合盒转运体G2与CD24在贲门腺癌中的表达及临床意义研究

刘月平，王小玲，张 勐，张玲玲，杨会钗，陈砚凝

贲门癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势。河北省是贲门癌的高发区，其病死率已居国内第2位，然而其病因至今仍不十分清楚。近年来研究发现其发病的生物学基础与肿瘤干细胞(tumor stem cell，TSC)密切相关，与诸多恶性肿瘤一样更倾向于它是一种干细胞疾病。

TSC是肿瘤中有自我更新能力且在分化增殖过程中逐渐具有异质性的肿瘤细胞。肿瘤被认为是一种干细胞疾病[1]，贲门腺癌的增殖分化取决于存在癌组织中的少量TSC。三磷酸腺苷结合盒转运体G2(ABCG2)是ABC家族的G2成员[2]，是公认的TSC标志物，它参与调节干细胞的分化及肿瘤的多药耐药机制[3]，它的高表达对患者的化疗及预后有着不良影响。近年来越来越多的学者研究发现，ABCG2在许多恶性上皮性肿瘤中广泛表达，如食管癌、贲门癌、结肠癌、乳腺癌及卵巢癌等，而在许多良性肿瘤中不表达或微量表达，这些都提示了ABCG2有可能参与肿瘤的恶性过程。CD24属糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白，是P-选择素配体的黏附分子，它由27个氨基酸组成,通过糖基磷脂酰肌醇黏附在细胞膜上[4]，参与正常组织结构的成熟、发育。Smith等[5]研究发现CD24在上皮和间质来源的肿瘤增殖中起关键的作用，近年来研究证实CD24在卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌及胰腺癌干细胞中高表达，特别是在恶性消化道上皮肿瘤中表达率高，如食管癌、胃癌、大肠癌等，因此CD24极有可能是TSC标志物之一。本研究旨在探讨ABCG2和CD24在贲门腺癌中的表达情况及其是否与贲门腺癌的恶性过程有关，为贲门腺癌的早期诊断和预后判定提供依据。

1　材料与方法

1.1材料选取河北医科大学第四医院病理科2010年1—10月贲门腺癌手术切除标本的存档蜡块共155例，其中贲门腺癌组织140例，癌旁组织15例，均经病理学检查证实。140例患者中男120例，女20例；年龄40～80岁，中位年龄62岁；低分化56 例，中高分化84例；有淋巴结转移者77例，无淋巴结转移者63例；浸润深度：侵及固有层(T0)1例，固有层及黏膜下层(T1)14例，肌层(T2)25例，浆膜(T3)44例，周围软组织(T4)56例；临床分期〔TNM分期标准参照2012年国际抗癌联盟(UICC)诊疗规范〕：Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期分别为26例、65例、44例、5例；Lauren分型[6]：肠型119例，弥漫型21例；所有患者术前未进行任何治疗且术后病理证实为腺癌。

1.2主要试剂ABCG2鼠抗人多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，鼠抗人CD24多克隆抗体购自上海迈新生物技术开发有限公司，DAB显色试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司，免疫组化Maxvision2/HRP检测试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。每次染色均同步设阴性和阳性对照。ABCG2阳性对照为胎盘组织，CD24阳性对照为扁桃体。

1.3方法采用免疫组化SP法测定ABCG2 和CD24在贲门腺癌中的表达情况。10%甲醛溶液固定石蜡包埋组织，连续4 μm 厚切片，常规脱蜡至水，进行SP 染色，分别用1.5%正常兔血清和0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)取代第一抗体作为替代对照和空白对照。

1.4阳性结果的判断ABCG2 与CD24蛋白均定位于细胞膜及细胞质中，阳性表现为瘤细胞胞膜及胞质内出现清晰可见的、定位准确的淡黄色至棕黄色颗粒。高倍镜下随机选取10个视野进行观察，染色强度0分为无色，1分为浅黄色，2分为棕黄色颗粒，3分为棕褐色颗粒。阳性细胞所占百分比，0分为阴性，1分为阳性细胞<10%，2分为11%～50%，3分为51%～75%，4分为>75%。将染色强度得分与阳性细胞百分比得分相乘，乘积>3分为免疫反应阳性。

1.5统计学方法所有数据应用SPSS 13.0软件包进行处理；蛋白表达与临床病理指标之间的关系分析采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1ABCG2的免疫组化结果

2.1.1ABCG2在癌组织和癌旁组织的表达情况贲门腺癌组织中ABCG2的阳性表达率为54.3%(76/140，见图1)，癌旁组织中的阳性表达率为13.3%(2/15)，差异有统计学意义(χ2=9.089，P<0.05)。

2.1.2ABCG2表达与临床病理特征间的关系ABCG2 的阳性表达率与贲门腺癌的分化程度、Lauren分型有相关性(P<0.01)，与患者的年龄、性别、浸润深度、淋巴结转移及临床分期均无相关性(P>0.05，见表1)。

2.2CD24的免疫组化结果

2.2.1CD24在癌组织和癌旁组织的表达情况贲门腺癌组织中CD24的阳性表达率为45.0%(63/140，见图2)，癌旁组织中的阳性表达率为6.7%(1/15)，差异有统计学意义(χ2=8.213，P<0.05)。

图1　ABCG2在贲门腺癌中的阳性表达(SP 400×)

图2　 CD24在贲门腺癌中的阳性表达(SP 400×)

2.2.2CD24表达与临床病理特征间的关系CD24的阳性表达率与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移、临床分期及Lauren分型有相关性(P<0.05)，但与患者的年龄、性别均无相关性(P>0.05，见表1)。

表1　ABCG2和CD24表达与贲门腺癌临床病理特征间的关系

3　讨论

20世纪80年代至今，世界上许多地区，如亚洲、欧洲、北美等出现了胃癌发病率下降的趋势，但令人费解的是食管癌、贲门癌的发病率却有所上升，欧美国家过去以鳞状细胞癌为主，如今逐渐演变为腺癌鳞癌对等的趋势[7]。在我国食管胃交界肿瘤中，贲门腺癌居然占到了80%以上，且贲门腺癌具有恶性程度高、外侵率高、淋巴结转移率高的特点[8]，已经严重危害到了人们的生存健康。

本研究结果表明，贲门腺癌组织中ABCG2、CD24的阳性表达率均高于癌旁组织，说明两种分子在贲门腺癌中具有一定的特异性，有可能参与癌的发生发展，并且从正常黏膜发展到癌，两者的表达是一个上调的过程。ABCG2和CD24与贲门腺癌的病理组织学分级密切相关，肿瘤分化差者其TSC数量多，因此二者阳性表达率也上调，这也说明了这两种标志物与干细胞的存在密不可分，而分化程度越低的癌组织其恶性程度也越高。近年来越来越多的学者研究发现ABCG2参与癌组织的多药耐药机制[2，9]，这种大量表达于癌组织细胞膜上的大分子蛋白发挥着泵的作用，它可有效地将已进入细胞内的化疗药物泵出细胞外进而弱化化疗效果，降低患者生存率，因此，即使癌组织分化程度较好，淋巴结无转移，此种分子在癌组织中的阳性表达也应引起人们高度警惕。与ABCG2相比CD24更富于侵袭性，由本研究结果可知，CD24不仅随肿瘤分化程度的降低、病理组织学分级的升高表达上调，更重要的是其还与贲门腺癌的浸润深度、淋巴结转移情况及TNM分期存在相关性，侵及浆膜或周围软组织(T3/T4)者CD24的阳性表达率较侵及黏膜层或固有肌层(T0/T2)者高，表明CD24与贲门腺癌的侵袭性呈正相关，是肿瘤恶化的证据；有淋巴结转移者CD24的阳性表达率高于无淋巴结转移者，表明CD24上调与肿瘤的转移有关。

探究贲门腺癌的形态学分化与某种分子是否具有关联性可以更好地使研究方向具体化，为进一步的分子生物学研究做好铺垫。探究这两种标志物与肿瘤形态学的关联时我们采用了Lauren分型，肠型一般具有较好的腺管分化，其分化以中高分化为主，也包括一部分低分化形态，但其特征有别于弥漫型，表现为腺管结构不清但瘤细胞呈巢团状、索状分布，而不是弥漫型的散在而广泛的浸润。在亚洲肠型胃癌患者较弥漫型居多，而弥漫型却较少受地理位置的影响，但更易发生淋巴结转移，因此预后差。

本研究结果还发现，在Lauren分型中弥漫型贲门腺癌患者癌组织中ABCG2、CD24的阳性表达率均高于肠型的阳性表达率，出现这种结果有两种可能性：(1)存在某种分子机制调控腺癌向肠型、弥漫型分化，这种机制所带来的结果是弥漫型ABCG2、CD24表达高于肠型；(2)弥漫型腺癌几乎是低分化的，而肠型腺癌包括中高分化腺癌和部分低分化腺癌，二者在弥漫型中的表达高于在肠型中的表达，其可能原因是肠型低分化腺癌所占比例较低。因此尽管肠型、弥漫型有差异，但并不能证明在形态学分化上具有表达的差异性。

TSC理论的提出以及近些年来人们对TSC表面标志物的研究对诸如贲门癌等早期症状不明显的恶性肿瘤提供了早发现、早诊断、早治疗的可能性，而对TSC表面特异性标志物的研究又提供了针对其特异抗原提供有效化疗药物的机会。本研究对TSC标志物ABCG2和CD24在贲门腺癌中的表达与临床病理特征的关系进行了分析，以期为贲门腺癌的诊疗提供理论依据。相信随着对TSC的研究，ABCG2和CD24作为TSC标志物将被越来越多的人所接受。

1Rüdiger Siewert J,Feith M,Werner M,et al.Adenoearcinoma of the esophaogastric junction:resuits of surgical therapy based on anatomical/topographic classification in 1 002 consecutive patients[J].Ann Surg，2000，232(3):353-361.

2Gil J,Stembalska A,Pesz KA,et al.Cancer stem cells:the theory and perspectives in cancer therapy[J].J Appl Genet，2008，49(2):193-199.

3Doyle LA,Yang W,Abruzzo LV,et al.A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells[J].Proc Natl Sci USA,1998,95 (26):15665-15670.

4Allen JD,Schinkel AH.Multidrug resistance and pharmacological protection mediated by the breast cancer resistance protein (BCRP /ABCG2)[J].Mol Cancer Ther,2002,1(6):427-434.

5Smith SC,Oxford G,Wu Z,et al.The metastasis-associated gene CD24is regulated by Ral GTPase and is a mediator of cell proliferation and survival in human cancer[J].Cancer Res,2006,66(4):1917-1922.

6Lauren P.The two histological main types of gastric caicinoma:diffuse and socalled intestinal-type carcinoma.An attempt at a histo-clinical classification[J].Acta Pathol Microbiol Scand,1965,64:31-49.

7Mohan A,Kandalam M,Ramkumar HL,et al.Stem cell markers:ABCG2 and MCM2 expression in retinoblastoma[J].Br J Ophthalmol,2006,90 (7):889-893.

8Shaheen NJ.Advances in Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma[J].Gastroenterology,2005,128(6):1554-1566.

9Kristiansen G,Sammar M,Altevogt P.Tumour biological aspects of CD24,a mucin-like adhesion molecule[J].J Mol Histol,2004,35(3):255-262.