高效液相色谱手性流动相添加法分离氟比洛芬对映体及其分离机制

沈芒芒 郑 烨 颜继忠 童胜强

（浙江工业大学药学院，浙江 杭州 310032）

环糊精作为高效液相色谱 (HPLC)流动相手性拆分剂广泛用于手性药物的拆分。大多数环糊精及其衍生物作为手性流动相添加剂的研究表明[1]，环糊精与溶质形成的包结配合物与固定相的相互作用减弱，保留时间缩短，分离选择性提高，可通过包结常数解释配合物在反相液相色谱中的保留行为，这对拆分手性化合物具有重要的意义。

氟比洛芬 (Flurbiprofen)是一种新型非甾体抗炎镇痛药，其化学名为2-(2-氟-4-联苯基)丙酸[2-(2-fluorobiphenyl-4-yl)propanoic acid]，临床上主要用于治疗风湿性关节炎、骨关节炎和外伤疼痛等。氟比洛芬分子中α位为手性碳原子，存在1对光学对映异构体（其结构见图1）。研究发现抗炎成分主要存在于S型异构体中，新的研究证明R型异构体可防治阿尔茨海默病[2]。因此，对氟比洛芬对映体进行拆分具有重要意义。已经有用荧光光谱法研究β-环糊精衍生物对氟比洛芬的包结作用[3]。Ye Jincui等采用高效液相色谱手性流动相法成功拆分了8种2-芳基丙酸类药物[4]。本文以羟丙基-β-环糊精为手性流动相添加剂，采用C18反相色谱柱,探讨了羟丙基-β-环糊精与氟比洛芬的包结方式,建立氟比洛芬对映体的高效液相色谱拆分法,同时考察了羟丙基-β-环糊精的浓度、流动相pH、有机调节剂和柱温等因素对手性拆分的影响。

Fig.1 The structure of Flurbiprofen(图1 氟比洛芬结构式)

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Water1525系列高效液相色谱仪，配Water1525双泵，Water2487二极管阵列检测器，Water717plus自动进样器，Water Breeze色谱工作站；Mettler-Toledo酸度计。

氟比洛芬对映体购于北京百灵威化学技术有限公司，含量大于99%；羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)购于山东新大精细化工有限公司；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。

1.2 色谱条件

色谱柱YMC-Pack ODS-A C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为pH=3.5的0.5%乙酸三乙胺缓冲溶液 （含25 mmol/L羟丙基-β-环糊精）:甲醇=80:20(V/V)；流速为1.0 ml/min；柱温为37℃；检测波长为247 nm；进样量为5 μL。

1.3 实验方法

精密称取12.5 mg的氟比洛芬对映体于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解稀释至刻度线，制成0.5 mg/mL标准溶液，于4℃冰箱中冷藏保存。临用时取上述标准溶液用0.45 μm微孔滤膜过滤，即可在色谱条件下进行拆分。

2 结果与讨论

2.1 保留机制

Armstrong等[5]报道了在液相色谱中，以环糊精衍生物作为手性流动相添加剂时，环糊精衍生物与对映体可能存在1:1或1:2的包结关系，当被拆分的溶质与环糊精只形成包结比为1:1的配合物而不形成1:2的配合物时，拆分过程中可能存在以下平衡：

其中F为被分离的自由溶质氟比洛芬，A是液相色谱柱固定相的吸附点，CD是羟丙基-β-环糊精分子，FCD是氟比洛芬与环糊精形成的1:1包结物，k为氟比洛芬与色谱柱固定相吸附点的吸附平衡常数，k1为氟比洛芬与环糊精形成1:1包结物的包结常数。被分离的溶质总量Ftot(mol)为：

由色谱容量因子(k'=(tR-t0)/t0)的定义[6]可知：

其中φ为相比率

通过上述(1)-(4)，可以得出

当环糊精与溶质以1:1结合时，经推导得出容量因子与环糊精浓度的关系式如下：

由(6)可得。将1/k'对环糊精浓度[CD]作图，若图为直线即符合上述式子，则可以说明氟比洛芬与环糊精形成1:1的包结物，并可以通过直线的斜率和截距求得相应的k1，即为包结常数。

2.2 不同色谱条件对手性分离的影响

2.2.1 HP-β-CD浓度对手性分离的影响

HP-β-CD作为手性拆分剂，其浓度对分离产生重要影响，具体见表1。实验表明，随着HP-β-CD浓度的增加，容量因子显著降低，这一变化趋势与式(6)一致。根据表1的数据分别以两对映体的1/k'对HP-β-CD浓度作图(图2)，得到线性回归方程分别为:

从图中看出两曲线都呈现良好的线性关系，符合式(6)的假设，说明氟比洛芬与HP-β-CD形成1:1包结物，且通过截距和斜率得出包结物的两对映体与HP-β-CD形成过程中的包结常数，其中 (+)-氟比洛芬的包结常数为1.83 L/mol，(-)-氟比洛芬的包结常数为1.67 L/mol。

实验过程中，在一定HP-β-CD浓度范围内，增加HP-β-CD的浓度，对映体的保留时间会缩短，但浓度过高会导致柱压过大，影响色谱柱的使用寿命，综合考虑各个因素，本文选用HP-β-CD的浓度为25 mmol/L。

表1 HP-β-CD浓度对容量因子及分离度RS的影响Table1 The effect of the concentration of HP-β-CD on the capacity factor and resolution of flurbiprofen

Fig2 The reciprocal value for experimental capacity factor plotted against the HP-β-CD concentration(图2 对映体容量因子的倒数值1/k'与手性拆分剂HP-β-CD浓度的线性关系)

2.2.2 流动相pH对手性分离的影响

在手性拆分中，pH对拆分效果影响较大。实验中同时考察了磷酸缓冲溶液和乙酸三乙胺缓冲溶液，用磷酸缓冲溶液柱压会高于乙酸三乙胺缓冲溶液，故本文采用乙酸三乙胺缓冲液进行不同pH值的考察。在其他条件相同时，氟比洛芬对映体在pH值3.0～4.6之间可以达到较好的分离，其结果见表2。这可能是因为氟比洛芬是一类有机酸，pH值较低时，药物处于分子状态，随着pH值增加，其电离程度增加，在反相柱上的保留时间缩短。综合考虑各个因素，本文选用pH值为3.5。

表2 流动相pH值对分离度的影响Table2 the effect of pH value of mobile phase on the resolution of flurbiprofen

2.2.3 有机调节剂对手性分离的影响

用HP-β-CD为流动相添加剂分离手性药物时，需要加入有机极性调节剂以降低其在固定相中的吸附，增大了对映体与环糊精的相互作用差异，从而达到分离目的。在实验中尝试了甲醇、乙腈等作为有机极性调节剂，在相同条件下，仅用乙腈不能分离氟比洛芬，而用甲醇可以达到较好的分离，且随着甲醇比例的增大，保留时间减少，但分离度也减少。同时在实验中尝试了甲醇和乙腈混合作为极性调节剂，随着乙腈浓度的增加，保留时间增加，分离效果增加不明显。故本文优选采用流动相中的纯甲醇比例为20%作为有机调节剂。

2.2.4 柱温对手性分离的影响

柱温对手性分离有一定的影响。在本文研究中发现，随着温度的升高，氟比洛芬对映体的保留时间缩短，但是分离度逐渐降低。为了达到好的分离效果，实验中采用的柱温为30℃。

在最佳色谱条件下，分离氟比洛芬对映体，分离结果见图3。

Fig.3 HPLC Chromatogram of Flurbiprofen Enantiomers(图3 氟比洛芬对映体拆分的高效液相色谱图)

3 结论

采用反相高效液相色谱手性流动相添加法建立了氟比洛芬对映体的手性分析方法，表明HP-β-CD与氟比洛芬对映体是以1:1的方式包结方式结合，同时考察了羟丙基-β-环糊精的浓度、流动相pH值、有机调节剂、柱温等对拆分效果的影响，确定了最优的手性分离条件。最终色谱条件为：YMC-Pack ODS-A C18(150 mm ×4.6 mm,5 μm)色谱柱，流动相为0.5%乙酸(pH3.5,三乙胺调节)含25 mmol/L羟丙基-β-环糊精:甲醇 (80:20,V/V)，流速为 1.0 mL/min,柱温为30℃，紫外检测波长为247 nm。

[1]胡育筑,陈玉英,陈德英.HP-β-环糊精对盐酸舍曲林异构体手性选择包合和色谱保留行为影响的研究[J].2004,34(1):239-245.

[2]邢志华,野津,王金宏,等.HPLC法拆分氟比洛芬.黑龙江医药,2012,25(2):198-200.

[3]苗家兵,周涛,唐课文,等.荧光光谱法研究β-环糊精衍生物对氟比洛芬的包结作用.光谱实验室,2010,27(4):1532-1536.

[4]Ye J C,Yu W Y,Chen G S,et al.Enantiomeric separation of 2-arylpropionic acid nonsteroidal anti-inflammatory drugs by HPLC with hydroxypropyl-β-cyclodextrin as chiralmobile phase additive [J].Biomed.Chromatogr.,2010,24:799-807.

[5]Armstrong D W,Nome F,Spino L A.Efficient detection and evaluation of cyclodextrin multiple complex formations[J].Am.Chem.Soc.,1986,108(7):1418-1421.

[6]陈立仁.液相色谱手性分离[M].北京:科学出版社,2006:134.