皂角刺联合肉桂抗肿瘤作用实验研究

赵 贝，李鸿儒，杜钢军

（河南大学药学院 药物研究所，河南 开封 475004）

皂角刺又称皂刺、天丁、皂针等，是我国传统中药材，来源广泛、价格低廉、作用多样化且疗效确切，毒副作用小，已被列为抗癌中草药之一［1］。虽然皂角刺可以从多个层面、多个环节、多个部位发挥作用，能消肿脱毒、妒乳、风疠恶疮、排脓、杀虫［2］。历代医家［3］认为，肿瘤的形成与阳气不足、阴寒凝滞、气滞血瘀等有关。如《灵枢·百病始生篇》云：“积之始生，得寒乃生，厥乃成积矣”。皂角刺在改善癌症患者食欲下降、高度乏力消瘦、抵抗力弱等阴盛阳衰症状方面未见报道。而肉桂性大热，味辛、甘，补元阳，暖脾胃，除积冷，通血脉，可以补火助阳、引火归源、散寒止痛、活血通经，且肉桂中的肉桂醛和肉桂酸具有抑制肿瘤细胞增殖的作用［4］。我们实验目的是考察皂角刺联合肉桂药酒相比皂角刺及肉桂药酒单独治疗，在改善荷瘤小鼠生长状态和抗肿瘤方面是否有更大的优势，并初步探讨其可能的作用机制。

1 实验材料

1.1 药品与试剂

皂角刺和肉桂，购自开封市天济大药房，经河南大学中药研究室鉴定为真品。皂角刺黄酒提取物、肉桂黄酒提取物、肉桂皂角刺（1∶1）复方黄酒提取物，含药量均为10%。浸泡1周，纱布过滤，供动物实验使用；无菌过滤滤液供细胞实验使用。

RPMI1640培养基、MTT、ConA（购自Sigma公司）；青霉素、链霉素（华北制药集团公司产品）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所产品）；小鼠Col－I、PAF、TIMP－I酶联免疫试剂盒（R＆D Systems产品）；CAT 测定试剂盒、T－SOD 测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 动物及瘤株

BALB／c小鼠，雌性，体质量24～26g，河南省医学实验动物中心提供（实验动物许可证号：SCXK豫2010－1－0002）；4T1 乳腺癌瘤株由中科院生物物理研究所梁伟教授惠赠，实验室于Balb／c 小鼠在体传代保存。

1.3 主要仪器

ElX800酶标仪（美国BIO－IEK）；LGR16－W 高速冷冻离心机（北京京立离心机有限公司）；电子天平FA1004N（上海精密仪器有限公司）；CO2培养箱（NAPCO 公司）；DYY－7C电泳仪（北京六一仪器厂）。

2 实验方法

2.1 对4T1乳腺癌细胞增殖的影响

取对数生长期4T1小鼠乳腺癌细胞，用体积分数0.25%的胰酶消化，调细胞数5×104个／mL，以100μL／孔接种于96孔板中，培养24h后加入含不同浓度皂角刺及其复方药酒的培养基100μL／孔，每组5个复孔（见表1）。48h后，除去培养基，加含MTT 0.5g／L的PBS，100μL／孔，继续培养4h后除去孔内液体，加入DMSO 100μL／孔，振荡10min，在酶标仪上570nm 处测吸光度（OD ），按下列公式计算抑制率［5］。

抑制率（%）＝（1－实验组OD 值／对照组OD值）×100%。

2.2 对4T1小鼠乳腺癌皮下移植肿瘤的影响

参照文献［6］方法，取对数生长期的4T1 小鼠乳腺癌细胞，无菌生理盐水调细胞数1×107个／mL，每只小鼠右腋部皮下接种0.2mL。接种后将小鼠按体质量分为4组：①对照组灌胃黄酒；②肉桂组灌胃肉桂黄酒提取物；③皂角刺组灌胃皂角刺黄酒提取物；④联合治疗组灌胃肉桂皂角刺复方黄酒提取物（取肉桂、皂角刺按1∶1比例配置）。每组10只。实验次日开始隔天监测小鼠体质量1 次，以20mL／kg 给药，2次／d，给药间隔为8h，连续24d。每日观察肿瘤生长情况，待肿瘤长出后用游标卡尺隔天测肿瘤的长度和宽度1次。肿瘤体积（mm3）＝肿瘤长度×肿瘤宽度×肿瘤宽度／2。

实验25d颈椎脱臼处死小鼠，剥取瘤块、肝脏、胸腺和脾脏，按下列公式计算抑瘤率、肝脏指数、胸腺指数和脾脏指数。

脏器指数（mg／g）＝内脏器官质量（mg）／体质量（g）；肿瘤抑瘤率（%）＝（1－T／C）×100%。

式中：C为对照组平均瘤质量（g）；T为实验组平均瘤质量（g）。

2.3 对小鼠乳腺癌4T1肺转移的影响

将接种25d左右生长良好的4T1小鼠实体瘤研磨稀释成细胞数5×106个／mL，以0.2 mL／只尾静脉注射于30只雌性BALB／c小鼠体内，建立乳腺癌实验性转移模型［7］。分组与给药同“2.1”。实验25d眶静脉取血分离血清用于检测Col－I、PAF、TIMP－1、CAT和T－SOD，然后处死小鼠，剥离出肺组织初步观察转移灶并计算肺上结节数。

2.4 对肺转移小鼠血清中酶的影响

将“2.2”中的小鼠血液样本，放置4 h 后离心，－20℃备用。临用前平衡至室温，按照ELISA试剂盒说明书步骤进行操作，测定荷瘤小鼠血清中Col－I、TIMP－1、PAF、CAT和T－SOD的水平。

2.5 对肺转移小鼠基质金属酶谱的影响

将“2.3”中的肺组织进行蛋白提取，将提取的蛋白进行明胶酶谱法电泳实验。模具准备安装好后制备灌注分离胶和浓缩胶，待胶凝固后置入电泳槽中，加入电泳缓冲液，用样品处理液处理蛋白后以20μL／孔加样。浓缩时80 V，到分离胶时可加大至100V，至溴酚蓝指示剂迁移至下缘时停止电泳。将胶剥离至含洗脱液（2.5% Triton X－100，50mmol／L Tris－HCl，5 mmol／L CaCl2，pH7.6）的培养皿中振荡洗脱2次，每次1h，然后用漂洗液（除不含Triton X－100 外，其余同洗脱液）漂洗2次，每次20min，将凝胶置于孵育液中37℃孵育12～16h。孵育结束后经染色液染色4h，倒掉染色剂，清水冲洗，倒入脱色液脱色2～3次至蓝色背景和白色条带清晰为止，显示出MMP－2（72KDa）和MMP－9（92KDa）为位于蓝色背景上的透亮带。

3 统计学处理

4 结果

4.1 对4T1乳腺癌细胞体外增殖的影响

肉桂及皂角刺对4T1小鼠乳腺癌细胞均没有直接杀伤作用，当二者联合使用，浓度达到50mg／L 时对其增殖有弱抑制作用，但没有统计学意义，见表1。

4.2 对4T1皮下移植及肺转移小鼠各项指标的影响

对4T1皮下移植小鼠体质量、瘤体积、瘤质量、抑瘤率及免疫器官的影响，见图1、图2、表2；对4T1肺转移小鼠体质量、肺转移率、血清中酶表达及基质金属酶谱的影响见表3、表4、图3、图4。

图1 皮下移植模型小鼠体质量生长曲线

图2 小鼠皮下移植瘤体积生长曲线

表1 不同浓度药物对4T1乳腺癌细胞增殖的影响比较

表2 各组小鼠瘤质量、抑瘤率及脏器指数比较（）

表3 各组小鼠肺转移情况比较（）

表4 各组小鼠血清中Col－I、TIMP－I、PAF、CAT、T－SOD表达比较（）

图3 肺转移模型小鼠体质量生长曲线

图4 对MMP－2及MMP－9的影响

5 讨论

我们从整体、细胞、分子3个水平考察了皂角刺、肉桂单独及联合运用对4T1小鼠乳腺癌皮下移植瘤和肺转移的抑制作用，皂角刺联合肉桂能协同抑制小鼠4T1乳腺癌的生长和转移，抑瘤率为46.19%，肺转移率降至67.72%，并可改善皂角刺单独用药导致的荷瘤小鼠体质量及免疫器官指数下降。实验所用皂角刺及肉桂药酒浓度均不能抑制小鼠乳腺癌细胞增殖，当二者联合使用，浓度达50 mg／L 时，可表现出对肿瘤细胞增殖的抑制作用。

肿瘤的侵袭与转移发生的最关键一步是对细胞外基质（ECM）和基底膜（BM）的降解。Col－I是细胞外基质主要成分，因而大量表达的Col－I对于肿瘤的转移是抑制的［8］。瘤细胞侵袭转移能力与其诱导产生MMPs降解ECM、BM的能力密切相关，且在许多肿瘤中呈高表达［9］。而结合并抑制MMPs的活性是TIMP的重要功能之一。TIMP的过度表达可抑制肿瘤的生长、浸润和转移［10］。实验发现，皂角刺联合肉桂能使Col－I表达显著增多，MMP－2、MMP－9表达降低，且肉桂可逆转皂角刺单独治疗造成的TIMP－I表达降低。皂角刺联合肉桂可通过调节COL－MMPs－TIMP通路保护细胞外基质发挥抗转移作用。

有研究［11］显示，肿瘤患者癌细胞转移和侵袭的程度与其高凝状态的程度密切相关。肿瘤与氧自由基及抗氧化系统之间呈相互作用，氧自由基水平的增高以及细胞抗氧化酶活性的改变可以导致肿瘤的发生。本次实验发现，肉桂可补充皂角刺在抗血栓方面的不足，增强其抗氧化方面的作用。

综上所述，皂角刺联合肉桂具有更强的抗肿瘤和抗转移作用。抗肿瘤作用可能与其抗血栓、抗氧化及一定的抑制肿瘤细胞增殖作用有关，其抗肿瘤转移的机制主要是通过保护细胞外基质来实现的。

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