靶向O型口蹄疫病毒shRNA转基因猪体细胞抗病毒活性研究

蔡扩军，马铈委，乔 军，孟庆玲，陈创夫，黄 炯，张再超，杨海波

(1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子832003；2.新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆乌鲁木齐830000)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由FMD病毒(FMDV)引起的牛、羊、猪等偶蹄类动物的一种急性、热性、高度接触传染性动物疫病[1]。该病传播速度快，宿主范围广，传播途径多，发病率高，对偶蹄类动物的危害严重。OIE将其列为必须实时通报动物疫病之一；我国将其列为一类动物传染病[2]。国内主要采用灭活疫苗免疫和扑杀相结合的防控措施，但该病仍然时有发生。因此，采取更有效的措施控制FMD疫情的发生和蔓延，已成为目前亟待研究的重要课题。

干扰RNA(RNA interference，RNAi)是通过一段短双链RNA分子引起具有相同序列的mRNA发生降解来关闭相应的基因表达的过程[3-4]。RNAi效应具有快速和高度特异性的特征。目前已知在昆虫和植物细胞中RNAi是其主要的抗病毒机制，但哺乳动物细胞感染病毒后几乎没有发现能自发诱导有效的抗病毒RNAi反应[5]。因此，人们一直在探索能够利用人工方法在哺乳动物细胞中建立有效的抗病毒RNAi防御策略。本实验室已通过转基因克隆相关技术培育了靶向FMDV的VP1基因的shRNA转基因猪。本实验对基因猪的体细胞水平进行抗病毒活性检测，评价其抗病毒活性，为进一步在动物个体水平上抗病毒活性的检测奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料 靶向O型FMDV转基因克隆猪(大白)由本项目组培育；O型FMDV OS/99株、猪抗O型FMDV的阳性血清由新疆畜牧科学院兽医研究所提供；细胞基因组提取试剂盒、RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；M icroRNA检测试剂盒购自Gene Copoeia公司；SYBR Green I购自TaKaRa公司；TRIzol和DMEM培养基购自Invitrogen公司；DNA酶I、反转录试剂盒 Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司；标记和检测系统DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit购自Roche公司；FITC标记的Protein A protein(FITC-SPA)购自Abcam公司。

1.2 引物设计及合成 采用分子生物学软件Primer 5.0设计siRNA、仔猪的内参基因HMBS[6](DQ845174)和O型FMDV VP1基因(HQ116289)特异性引物。siRNA上游引物：5'-GCCAAGAGGACAAAGCGCT G-3'；通用下游引物由GeneCopoeia公司提供。HMBS上游引物：5'-AGGATGGGCAACTCTACCTG-3'；下游引物 5'-GATGGTGGCCTGCATAGTCT-3'。VP1上游引物：5'-TCAAGCCAAAGGAACAAGT-3'；下游引物：5'-TAGACGGTCGCTAAGACAC-3'。外源基因鉴定上游引物：5'-GAAGATCTCCCAGTGGAAAG-3'；下游引物5'-CGGAATTCTTGGAAAAAAGCTACAGA TCACC-3'，由华大生物科技有限公司合成。

1.3 转基因猪体细胞的制备及基因组DNA的PCR及southern blot鉴定 取同一品种、同为1日龄的转基因猪(4头)和非转基因猪(1头)耳尖，按照组织块消化法制备体细胞进行细胞培养。按照细胞基因组提取试剂盒操作说明书分别提取转基因猪和非转基因猪体细胞的基因组DNA。采用外源基因鉴定引物进行PCR扩增，产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳分析，将目的片段从凝胶中回收纯化并由华大基因公司进行测序。采用EcoRⅠ和KpnⅠ消化约25μg基因组DNA，酶切产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离后转移至Hybond+尼龙膜，利用外源基因鉴定引物PCR扩增回收片段为探针，按ECL直接核酸标记及检测系统说明书进行southern blot鉴定。阳性、阴性对照分别为同时用EcoRⅠ、KpnⅠ双酶切的shRNA重组质粒和非转基因猪体细胞的基因组。

1.4 病毒感染试验 分别将制备的4头转基因和1头非转基因猪的体细胞培养于6孔细胞培养板，在P3实验室进行病毒感染试验。以10TCID50FMDV感染细胞16h后，以猪抗O型FMDV阳性血清为一抗、FITC-SPA为二抗，参照文献[7]的方法进行间接免疫荧光试验(IFA)。

1.5 感染FMDV猪体细胞中病毒载量的检测 构建pMD-VP1和pMD-HMBS重组质粒，并将pMD-VP1和pMD-HMBS按1∶10梯度稀释，各建立6个梯度，利用拷贝数和CT值做标准曲线。以10TCID50FMDV感染细胞12h、24h、36h、48h后，将孔内的感染细胞及培养液反复冻融3次，分别用TRIzol提取各孔病毒细胞液的总RNA，按照反转录试剂盒说明书进行反转录反应。按照SYBR Green I荧光定量PCR试剂盒说明书进行荧光定量PCR检测。PCR反应体积为25μL。扩增条件为：95℃30s；95℃ 10s、59℃ 30s、72℃ 30s，40个循环；72℃10s。在延伸阶段检测荧光强度，收集信号。在相同条件下与待测样品同时进行荧光定量PCR反应，同时扩增HMBS内参基因，根据HMBS拷贝数值采用最大二阶导数法(2-ΔΔCt)进行统计学分析[8]。同时应用SPSS17.0统计学分析软件进行t检验。

2 结 果

2.1 转基因猪体细胞的制备及基因组DNA的PCR及southern blot鉴定 制备的体细胞形态正常，生长状况良好(图1)。1、2、4、9号转基因克隆仔猪耳组织基因组DNA PCR扩增出402bp的目的条带，而同日龄的非转基因猪体细胞基因组DNA没有扩增出目的条带(图2)，同时测序结果和Southern blot试验结果也证明转基因克隆仔猪基因组DNA中携带有靶向FMDV VP1基因的shRNA基因片段(图3)。

2.2 FMDV的细胞感染试验 非转基因猪体细胞在攻毒后约8h开始病变，而转基因猪体细胞在攻毒后约12h开始病变。攻毒后36h观察CPE，转基因猪体细胞和非转基因猪体细胞CPE出现明显的差异。在攻毒后48h，两者80%～90%的细胞均变圆，部分细胞脱落，差异不明显。IFA试验结果显示，转基因猪体细胞的荧光强度比非转基因猪体细胞的荧光弱，表明FMDV在转基因猪体细胞内的增殖量比在非转基因猪体细胞要少(图4)。CPE观察结果和IFA结果均表明转基因克隆仔猪体细胞具有一定抑制FMDV复制的能力。

2.3 感染FMDV体细胞VP1基因RNA相对拷贝数的检测结果 经Roche Light Cycle@480软件分析，pMD-VP1和pMD-HMBS的扩增其Error值趋于0，扩增结果具有良好的线性关系，检测数据具有高度的相关性，其中VP1和HMBS的扩增效率接近2。经数据分析表明，各组VP1基因的初始拷贝数，经内参基因校正，根据2-ΔΔCt法计算出各个样本的VP1基因RNA相对拷贝数，应用SPSS17.0统计软件t检验。结果显示：攻毒后，shRNA转基因猪体细胞对VP1基因的复制具有不同程度的抑制作用，4头转基因猪之间差异不显著(p>0.05)。其中攻毒12h、24h、48h实验组分别与对照组比较差异不显著，攻毒后36h实验组与对照组比较，4头转基因猪的平均抑制效率为53.6%，差异显著(p<0.05)。表明体细胞在攻毒48h内可以抑制VP1基因的表达，其中以攻毒后36h的抑制效果尤为显著(图5)。

3 讨论

FMDV属于小RNA病毒科、口蹄疫病毒属，为单股正链RNA病毒，全长约8.5kb，可直接作为信使RNA，是理想的siRNA靶标，适于进行RNAi的研究[9]。研究表明，RNAi是一种抑制FMDV的有效手段[10-13]。将siRNA技术和转基因技术相结合产生的RNAi转基因动物具有的稳定性、可传递性、高效性等优势，突破了RNAi只在细胞水平发挥作用的局限，提高动物群体的整体抗病毒能力，具有应用前景的防控手段。

目前，转基因动物主要分别从DNA、转录、翻译和整体表型的水平进行检测和评价[14-16]。其中DNA水平的检测包括PCR技术检测、Southern blot检测、DNA拷贝数的检测、整合位点的检测；RNA水平的检测主要包括northern印迹杂交、逆转录PCR和RNA斑点杂交等；翻译水平的检测包括western blot和酶联免疫吸附法；整体水平的观察对转基因动物而言主要遵从实质等同性原则，即转基因动物除表现出外源基因表达蛋白的性状外，其他生物学特性都要与受体动物相同。但目前为止，国内外对通过RNAi术产生的转基因动物的检测手段研究有限，未形成统一的标准。

本研究在成功培育转基因克隆猪的基础上，选择了合适的检测方法对靶向O型FMDV shRNA转基因猪体细胞进行抗病毒活性的检测和评价。首先制备并培养了转基因猪体细胞，对细胞的基因组DNA进行了PCR和Southern blot鉴定，然后进行了FMDV感染细胞试验，观察不同时间点的CPE，IFA检测了FMDV在转基因和非转基因猪细胞内的含量，并通过荧光定量PCR检测了FMDV在转基因猪体细胞的复制水平。结果表明：与非转基因猪体细胞相比，转基因猪体细胞在攻毒后出现CPE的时间延迟，病变减轻，荧光量明显的减少，在攻毒后36h时，细胞中FMDV基因组RNA相对拷贝数显著降低，表明FMDV在转基因猪体细胞内的增殖水平要低于非转基因猪体细胞，显示转基因猪体细胞具有一定的抗FMDV的活性。

尽管shRNA转基因动物体细胞抗病毒能力有限，但可以提供早期对病毒复制的抑制作用。体外抗病毒活性在一定程度上可初步反映机体抗病毒能力，但体外与体内还存在一定的差别，为了解转基因猪抵抗FMDV能力还要进一步对猪进行攻毒试验，以便在动物个体上评价靶向FMDV shRNA转基因猪体抗病毒活性。

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