牛乳样品中布鲁氏菌的分离和鉴定

易新萍，马晓菁，闫晶华，谷文喜，刘丽娅，叶 锋，吐尔洪·努尔，钟 旗*

(1.新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆乌鲁木齐830000；2.新疆动物卫生监督所，新疆乌鲁木齐830017)

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种人畜共患的传染病，属于我国规定的二类动物疫病。奶牛是Brucella病最易感的动物之一，主要损害其生殖系统，造成奶牛流产、不孕及乳房炎等症，并可以经污染的奶制品、流产物等途径感染人，导致人的波状热、关节痛及泌尿生殖系统疾病[1]。因此，奶牛Brucella病严重危害奶牛业，并对公共卫生造成严重的威胁。

病原分离鉴定是诊断奶牛Brucella病的传统方法，但以往病原体的分离主要以病料、流产胎儿、流产物等为分菌样本，该类样本数少，取样困难，对操作人员安全危险性大[2]。本研究直接采集奶样进行细菌分离，并采用PCR结合常规生化实验鉴定了分离的Brucella，为新疆地区布病的诊断及防治提供了依据。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料 采集自3个不同地区奶牛场SAT 检测为阳性奶牛(抗体效价 1∶200～1∶800)的牛乳样品25份，-20℃冻存备用；布氏琼脂培养基(BBLTMBrucella Agar)和TS液体培养基均购自Becton and Dickinson company公司；改良Brucella选择添加剂(OXOID Ltd)、PCR所用试剂均购自北京庄盟生物有限公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；Brucella国际标准菌株牛种544A和羊种16M、国内疫苗株牛种A19、羊种M 5及猪种S2、大肠杆菌DH5α均由新疆畜牧科学院兽医研究所Brucella病研究室保存。

1.2 细菌培养 将冻融的奶样混匀，取300μL奶样接种于含Brucella添加剂的布氏琼脂培养基上，37℃5%～10%CO2培养，观察菌落形态。

1.3 布鲁氏菌属的PCR鉴定 挑取培养的疑似Brucella菌落置于含500μL TS液体培养基中，37℃孵育24h后100℃10m in，离心后取上清液作为PCR模板。采用VirB8-PCR方法扩增Brucella的VirB8基因，进行Brucella属鉴定[3]。

1.4 布鲁氏菌种和型的PCR鉴定 参照文献[4]和[5]AMOS-PCR方法，组合插入序列IS711、牛种(1、2、4、3a 型)、牛种(5、6、9、3b 型)和羊种(1、2、3型)4个引物，优化PCR反应条件：94℃5m in；94℃60s、60℃90s、72℃60s，40个循环；72℃10min。对Brucella分离株进行种型鉴定。

1.5 Bruce lla生物型的生化鉴定 按照布鲁氏菌标准鉴定方法进行细菌学鉴定[6]。以Brucella国际标准菌株牛种544A和羊种16M为实验参考株进行生化鉴定试验，实验中CO2需要量、H2S产生、染料抑制(硫堇、复红)、单项血清凝集(A、M、R)等试验结果均成立条件下判定分离菌株的生物亚型。

2 结 果

2.1 细菌分离培养 将奶样接种于含Brucella添加剂的布氏琼脂培养基，培养至第4d后，25份样品有9份培养基上生长出0.5mm～2.0mm大小无色、闪光圆形、湿润、凸起的疑似小菌落(图1)。

2.2 PCR鉴定 应用VirB8-PCR方法[3-4]对疑似Brucella菌落进行PCR鉴定，以A19疫苗株、羊种M 5株、猪种S2疫苗株和大肠杆菌DH5α分别为阳性对照和阴性对照。VirB8-PCR鉴定结果表明，9个Brucella分离株均扩增出约700bp的特异性片段，与阳性对照一致。阴性对照大肠杆菌DH5α则未见目的片段(图2)。

2.3 Bruce lla种型PCR鉴定 采用AMOS-PCR方法[4-5,7]对VirB8-PCR阳性Brucella分离株进行种型鉴定，PCR结果表明牛种Brucella(1、2、4、3a型)扩增出约500bp的特异性片段，牛种Brucella(3b、5、6、9型)扩增出约1700bp的目的片段，羊种Brucella(1、2、3型)扩增出750bp的目的片段(图3)。

2.4 生化鉴定 应用常规生化试验对PCR鉴定的牛种(3、5、6、9型)Brucella、羊种(1、2、3型)Brucella进行生物型鉴定。经中国疾病与预防控制中心传染病预防控制所Brucella病组鉴定表明，从2个牛场的牛乳中分离到的7株Brucella为牛种Brucella生物3型，1个牛场中分离的2株Brucella为羊种Brucella生物3型(表1)。

表1 牛乳中分离菌株生化鉴定结果Table 1The results of identification of isolated Brucella strains by biochem ical test in raw milk

3 讨论

病原分离鉴定是诊断Brucella病的传统方法和金标准，但采集病料困难，操作风险大，方法繁琐、分菌率低。牛乳中含有多种细菌，在细菌的分离过程中，常用的Brucella培养基中添加了改良的Brucella选择性添加剂，有效地抑制了Brucella以外的各类细菌的生长，能分离到Brucella病原体。本实验研究表明，对奶牛Brucella病同一感染群，SAT检测奶牛Brucella病抗体效价为1∶200～1∶400时，奶牛的乳样分菌率高达50%以上。该方法省时、简便，取样容易，一般在3d～5d内就可得到病原体，为奶牛Brucella病的确诊提供了切实可行的诊断方法，同时对生牛乳Brucella污染的监测具有重要的食品卫生学意义。

各型Brucella在各种动物间有跨物种间传播，确认动物感染群及其病原的种型，对确定流行病学状态、传染源及采取合适的防控措施有着重要的实用价值[8]。本研究结合PCR技术，快速准确地对新疆地方Brucella分离株进行了种的鉴定。该方法减少了操作者在不可控情况下接触活菌的机会，极大地降低了Brucella扩散污染的生物安全问题。应用生化试验确诊了新疆地方Brucella分离株的生物亚型为牛种3型和羊种3型。从牛乳中分离到羊种Brucella 3型更进一步表明该地区Brucella羊种3型已成为该病流行的优势菌种[9]，这将严重威胁当地的公共安全。本研究结果为制定新疆地区Brucella病的防控措施提供了重要的参考价值。

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[6]闻玉梅主编.现代微生物学[M].上海：上海医科大学出版社，1999，455-469.

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