肾血管性高血压大鼠胸主动脉内中介素IMD基因与RAAS的相关性研究

董 劲，程水泉 (.陕西省汉中市中心医院心内科，陕西 汉中 73000;.陕西省汉中市中心医院呼吸科，陕西 汉中 73000)

肾素血管紧张素系统(RAS)在高血压血管重塑过程中起了不可忽视的作用，已有实验表明，AngⅡ可以刺激胸主动脉平滑肌细胞增殖、肥大，并促进其胶原合成。醛固酮(ALD)也可以在血管组织局部合成并可在局部独立地调控血管重塑。

中介素(Intermedin，IMD)又叫肾上腺髓质素 2(Adrenomedullin 2，ADM2)，是一种寡G蛋白偶联受体oGPCR，自身并无活性，只有当他与其受体活化蛋白RAMPs包括RAMP1、RAMP2、RAMP3才发挥其降压、扩血管、心脏保护等作用。

目前为止，曾强发现IMD和RAMP1、RAMP2、RAMP3在自发性高血压大鼠(SHR)主动脉中蛋白和mRNA水平均上调[1]，说明IMD参与高血压大血管的重塑。因此，为进一步证明IMD在高血压大鼠血管重塑中的作用，本实验旨在研究肾血管性高血压大鼠血管重构中IMDmRNA表达的规律，及IMD的变化与RAS的激活有无关系。

1 材料与方法

1.1 建立肾动脉不全结扎高血压大鼠模型:选用重280～320 g健康雄性SD大鼠(四川省中医药研究所)。麻醉后动物取右侧卧位，分离左肾动脉，将直径为0.22 mm的针灸针放置在左肾动脉上[2]，用手术缝线结扎，抽出针灸针。假性手术组分离左肾动脉，仅用手术缝线绕过，不予结扎。以术后血压超过 18.7 kPa(140 mm Hg，1 mm Hg=0.1333 kPa)时即确定动物高血压形成用于药物实验。所有动物术后饲养于清洁级动物实验室，术后2周高血压已初步形成，第4～6周趋于平稳。

1.2 血压测量:采用RBP_III型大鼠血压心率仪(中日友好医院)应用标准尾套法在大鼠清醒状态下测定尾动脉血压。测量前大鼠在34℃下预热10～15min。测量时间设置在每天上午8:00～12:00，每只至少进行3次测定，取3次结果的平均值作为血压数值。在术后第1个月每周至少测定血压一次，以后2周测定血压1次。

1.3 实验动物分组:实验分成五组:①单纯不完全结扎一侧肾动脉(高血压对照组);②不完全结扎一侧肾动脉加缬沙坦组;③不完全结扎一侧肾动脉加左旋氨氯地平组;④不完全结扎一侧肾动脉加依那普利;⑤假手术组。以上用药组于术后第5周开始分被给缬沙坦30 mg/(kg·d)，左旋氨氯地平2.5 mg/(kg·d)，依那普利 20 mg/(kg·d)，1 次/d，连续给药8周。各组药物剂量的选择参照文献[3－5]。以上各组分笼喂养，给药组分别溶于蒸馏水中通过胃管灌饲给药。假手术对照组及高血压对照组给予同等容积的溶剂。对那些被不完全结扎但在术后第4周末血压仍未升高的大鼠，将在给药前从药物实验中剔除。在给药时间结束之时，再次测量动物体重和血压。

1.4 组织分离和标本准备:治疗8周末，处死大鼠，分离腹主动脉，取从膈肌至第一肋间动脉节段之间的胸主动脉，去除动脉壁脂肪和结缔组织。将胸主动脉截为三段:一段浸入Trizol中迅速用眼科剪剪碎，再用组织匀浆机匀浆，分别置于－80℃液氮中贮存，用于实验中mRNA检测;一段固定在4%多聚甲醛中过夜，行常规石蜡包埋，以用作胸主动脉中膜厚度及中膜截面积测量;第三段分别用于胸主动脉AngⅡ和ALD含量的检测。

1.5 主动脉中膜厚度及中膜截面积测量:石蜡包埋主动脉组织连续性切片5张，其切面与血管纵轴垂直。对这些组织切片进行弹力纤维Orcein染色及苏木素染色。组织切片图像通过显微摄像系统转换至电脑中储存，并采用Version 4.6 spot图像分析系统测量主动脉中膜层厚度及中膜截面积。以夹在主动脉壁内、外弹力纤维层之间的环形区域为中膜层截面，而内、外弹力纤维层之间平均距离为中膜层厚度。

1.6 胸主动脉血管紧张素Ⅱ含量和醛固酮的检测:胸主动脉经称重后即放入备有0.5 mmol/L乙酸的试管中，入100℃水浴中煮沸 10min，经冷却后进行匀浆，4℃离心 20min(3000 r/min)，取上清液，置于－20℃冰箱保存。采用放射免疫法检测每克胸主动脉AngⅡ和ALD含量的检测。药盒购自北京解放军总医院科技园开发中心放免所，按试剂盒说明书操作。

1.7 RT－PCR法测定大鼠胸主动脉中IMDmRNA及受体mRNA:总RNA抽提剂(Trizol)购自Gibico公司，逆转录聚合酶链反应(RT－PCR)试剂购自Promega公司。IMD及受体引物序列为从国际互联网CDNA文库检索的原始序列，参照文献设计[6]。六对引物均由上海生物工程公司合成。胸主动脉总RNA提取和IMD及受体CRLR，RAMP1、2、3mRNA的测定，用Trizol一步法提取胸主动脉中总RNA、MMLV逆转录酶及Oligo(dT)15primer逆转录成单链cDNA。PCR产物经0.8%琼脂糖电泳分离和溴乙锭染色后，凝胶成像及定量扫描仪分别获得376bp和446bp条带，IMD mRNA/β－actin mRNA的光密度比值即为 IMD mRNA的相对含量。CRLR和RAMPS的PCR反应条件，详见表1。

表1 扩增的寡核苷酸引物

1.8 统计学处理:采用SPSS13.0统计软件(SPSS for Windows 13.0)对所得数据进行分析，各组数值以均数±标准差()表示。组间比较采用单因素方差(One－way ANOVA)分析，Student－Newman－Keuls(SNK)方法检验，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生理特征:药物治疗8周后Rh大鼠的血压较其他各组大鼠显著升高(P＜0.01)，而Rh大鼠的体重却明显低于其他各组(P＜0.05)。血压Rh组显著高于其他组(P＜0.01)，Ena组、Val组、Aml组和SO组组间比较，差异无统计学意义(P=0.395)。5组心率比较，差异无统计学意义(P=0.110)，详见表2。

表2 5组实验大鼠生理特征对比()

表2 5组实验大鼠生理特征对比()

注:与 So组比较，①P ＜0.05;与 Rh组比较，②P ＜0.05;与 So组比较，③P ＜0.01

项目 Rh组 Val组 Aml组 Ena组 SO 组9 6体重(g) 291±3① 325±11①② 312±5①② 318±5①② 357±8心率(次/min)427±8 450±9 455±5 450±8 320±7血压(mm Hg)174±4③ 140±9② 141±6② 137±5②大鼠(只数)877128±3

2.2 各实验组胸主动脉中膜厚度及中膜截面积的对比:肾性高血压组(Rh)胸主动脉中膜厚度(图1)及中膜截面积(表3)均较其他各组有显增性增加(P＜0.01)，其中胸主动脉中膜厚度Ena和Am较Val组有轻度减小的趋势，但无统计学差异(P=0.227)，即Rh组胸主动脉中膜厚度显著性高于其他各组，而其他各组组间无统计学差异。中膜截面积组显著高于其他组(P＜0.01)，So组、Ena组、Val组和 Aml组组间比较，差异无统计学意义(P=0.237 ＞0.05)。

图1 五组大鼠胸主动脉组织弹力纤维Orcein染色及苏木素染色切片

表3 5组实验大鼠中膜厚度及截面积的对比()

表3 5组实验大鼠中膜厚度及截面积的对比()

注:与 So组比较，①P ＜0.01;与 Rh组比较，②P ＜0.05;与 Rh组比较，③P ＜0.01

组别 例数 中膜厚度(μm) 中膜截面积(mm2)Rh组 8 141.63 ±4.915① 0.624 ±0.014①Val组 7 123.86 ±4.066② 0.542 ±0.018③Aml组 7 116.09 ±5.852③ 0.507 ±0.025③Ena组 9 115.82 ±5.933③ 0.509 ±0.010③So组 6 109.53 ±5.933③ 0.493 ±0.024③

图2 胸主动脉内AngⅡ含量比较

2.3 各实验组胸主动脉内ALD、AngⅡ含量的对比:胸主动脉内AngⅡ含量，Rh组、Val与Aml两两比较，差异无统计学意义(P=0.207)，且显著高于 Ena组与 So组(P＜0.05)，Ena组显著高于So组(P＜0.05)(图2)。胸主动脉内ALD含量，Rh、Aml组显著高于其他三组(P ＜ 0.05)，Ena、Val组组间无差异(P=0.815)，又均显著高于 So组(P ＜0.05)，见图 3。

图3 胸主动脉ALD含量比较

2.4 各实验组胸主动脉内IMDmRNA及受体mRNA的对比:图4(a)显示实验大鼠胸主动脉中IMDmRNA泳带，上为标准β－ action 泳带，自左到右顺序依次为 Rh、Aml、Ena、Val、和 So。结果显示Rh组较其余组显著增高(P＜0.05)，其余组两两比较差异无统计学意义(P=0.539)，见图4(b)。

图4 胸主动脉IMDmRNA比较

3 讨论

2007年ESH/ESC高血压指南在强调降压达标的同时，还充分强调了高血压的诊疗必须考虑总体心血管危险，更加强调识别靶器官损害和针对疾病不同阶段合理施治的重要性[7]，即高血压药物治疗不仅是为了缓解或消除症状，最终目的是保护靶器官和改善患者预后。

高血压血管重塑与其靶器官损害及预后密切相关，血管重构发生相关的因素包括机械性因素和体液因素等。体液因素中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是其中最为重要的。有学者给大鼠长期注射AngⅡ可促使血管肥厚发生。结果提示RAS，尤其是血管壁局部RAS，在血管肥厚发生中具有重要作用。

中介素(IMD)是运用种系发生图谱的方法分析基因库而发现的一种降钙素基因相关肽(CGRP)家族中的多肽，RTPCR，Northern blotting及免疫学方法测定出IMD在人和脊椎动物的垂体、消化道、肾脏、淋巴组织和胰腺中表达，在血管、左心室甚至在心房、右心室和血清也有低水平的表达。IMD具有抑制心肌重塑和强大的扩张血管等作用，目前还没有IMD与血管重塑的报道。

为研究局部组织中IMD与血管重构的关系及IMD与RAAS的激活有无关系，本实验设计了肾血管性高血压大鼠模型，并用药物干预血压。结果显示，Rh组胸主动脉的IMDmRNA较假手术组显著升高，利用三种不同降压药物在降低血压相同水平时IMDmRNA降低的水平相似，然而三种药物对胸主动脉AngⅡ和ALD水平的影响显著不同:ALD水平在Rh、Aml组显著高于其他三组，Ena、Val组又显著高于So组。AngⅡ水平在Rh组、Val与Aml两两比较无差异，且显著高于Ena组与So组。研究结果支持此假设:血液动力学负荷并非RAAS的激活可能是受损靶器官内的IMD增加的机制之一。

笔者的研究表明，Rh组胸主动脉血管出现管壁厚度明显增加，无论是中膜截面积、中膜厚度均显著高于其他组，同时Rh组胸主动脉中IMDmRNA也显著高于其他组，应用依那普利、左旋氨氯地平和缬沙坦后，胸主动脉中膜截面积、中膜厚度均显著下降，说明IMDmRNA可能参与高血压血管重塑的调节，而三种降压药对高血压血管重塑的逆转作用无差异，说明IMD对血管重塑的调节作用没有差异。血管重塑与RAAS、高血压和IMD三者的相互关系之中，高血压与中膜截面积、中膜厚度的变化一致，而IMDmRNA的变化从属于高血压的变化，血管重塑与RAAS无直接关系。

血管重塑实际是血管壁自分泌或旁分泌的许多复杂的刺激因子和抑制因子之间相互作用的结果。本实验显示，三种降压药从不同机制降低血压，并且改善了血管重构，效果均没有显著性差异，说明血管重构的机制不限于RAAS，扩展了血管重塑的机制，作为自分泌或旁分泌的IMD变化独立于RAAS。

[1]Zeng Q，Yuan Y，Wang X，et al.Upregulated expression of intermedin and its receptor in the myocardium and aorta in spontaneously hypertensive rats[J].Peptides，2009，30(2):391.

[2]史衍杰，陈建光.高血压动物模型的建立与应用[J].北华大学学报(自然科学版)，2006，7(6):501.

[3]田晓虹.肾性高血压大鼠心肌组织和血浆醛固酮变化对左室肥厚和心功能的影响及缬沙坦的干预作用[J].临床心血管病杂志，2006，22(10):596.

[4]段留法，郑秋甫，曾 强，等.左旋氨氯地平对自发性高血压大鼠内皮舒张功能的影响[J].军医进修学院学报，2002，23(3):173.

[5]陈亮波.依那普利不对DOCA－盐诱导的高血压大鼠发生影响[J].高血压杂志，2004，12(3):245

[6]Takeda Y.Vascular synthesis of aldosterone:role in hypertension[J].Mol Cell Endocrino，2004，217(1):75.

[7]Task Force for the Management of Arterial Hypertension of ESH/ESC.2007 guidelines for the management of arterial hypertension[J].J Hypertens，2007，25:1105.