抑制肝癌SMMC-7721细胞TWIST基因表达对细胞侵袭能力的影响

乔泽强

南阳医学高等专科学校第一附属医院普外一科 南阳 473058

肝癌细胞的侵袭转移使其临床进展迅速且预后较差，病死率高。研究肝癌细胞浸润转移的影响因素并阐明其机制，对于提高患者的生存率至关重要。已有研究[1-3]表明TWIST在乳癌、胃癌、结肠癌等组织中高表达且与肿瘤的侵袭转移密切相关。作者设计合成了靶向TWIST基因的小干扰RNA，转染入人肝癌SMMC-7721 细胞，采用RT-PCR和Western blot分析转染细胞TWIST mRNA和蛋白表达水平，并观察体外侵袭能力的变化。

1 材料与方法

1.1细胞和主要试剂人肝癌 SMMC-7721 细胞株购自上海细胞生物研究所； 脂质体转染试剂LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)，RPMI 1640培养基(Gibco公司)，TWIST兔抗人多克隆抗体、E-cadherin兔抗人多克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，cDNA第一链合成试剂盒及PCR扩增试剂盒(上海生工生物工程服务有限公司)，Boyden小室(郑州金赛尔生物科技有限公司)，Matrigal胶(BD公司)。引物由北京赛百盛生物工程公司合成。

1.2靶向TWIST基因siRNA的合成根据相关文献及查GenBank中TWIST基因(NM_000474.3)的序列，合成靶向TWIST的siRNA序列: 5’-UG GAUUUGUACCAUUCUUCUG-3’。用Blast对选中的特异性siRNA序列和无关序列进行同源性分析。同时设计阴性对照siRNA，其碱基序列随机排列，与人类基因的外显子无同源性。

1.3细胞分组SMMC-7721细胞在含100 g/L胎牛血清，1×105U/L 青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养基中于37 ℃、体积分数5% CO2条件下培养。取对数生长期细胞接种于6孔板，每孔 2×105个，培养至细胞密度达50%，参照LipofectamineTM2000说明书转染。实验分为3组：空白对照组(未转染)，阴性对照组(转染阴性对照siRNA)，TWIST siRNA组(转染靶向TWIST的siRNA)，浓度均为50 nmol/L。培养6 h后，转为全培液培养，继续培养48 h，收获细胞，进行指标检测。

1.4TWIST和E-cadherinmRNA的检测采用半定量RT-PCR 方法。Trizol试剂提取细胞总RNA，电泳鉴定其完整性，逆转录得cDNA，PCR扩增TWIST和E-cadherin基因。TWIST引物上游序列：5’-TGGTCCATGTCCGCGTCCCA-3’，下游序列：5’-CGCCCCACGCCCTGTTTCTTT-3’，产物大小为207 bp；E-cadherin引物上游序列：5’-TGATTCTGCT GCTCTTGCTGTT-3’，下游序列：5’-CAAAGTCCTG GTCCTCTTCTCC-3’，产物大小为128 bp；内参β-actin引物上游序列：5’-GGGAAATCGTGCGTGACA-3’，下游序列：5’-TCAGGAGGAGCAATGATC-3’，产物大小为385 bp。使用SYNGENE凝胶分析系统软件扫描，以目的基因条带与内参基因条带灰度值的比值作为目的基因mRNA的相对表达量。

1.5TWIST和E-cadherin蛋白的表达检测采用Western blot方法。提取各组细胞总蛋白，用考马斯亮蓝G250结合法测定蛋白质浓度。各组样品分别取总蛋白300 μg，经100 g/L SDS-PAGE电泳后转PVDF膜。与特异性一抗37 ℃温育2 h，4 ℃过夜。与二抗室温孵育2 h后，ECL化学发光剂于暗室中曝光和显影。测定目的条带的光密度值，以其表示目的蛋白的相对表达量。

1.6细胞体外侵袭力采用Boyden小室检测。小室上、下室之间用孔径8 μm的聚碳酸酯膜分开，膜上铺人工基底膜Matrigal 120 μL/室，下室加200 μL趋化因子，上室内滴入单细胞悬液(5×105L-1)400 μL/室，37 ℃、体积分数5% CO2条件下培养24 h。取出小室，黏附到滤膜下室面的细胞用甲醛固定，常规HE染色，400倍显微镜下随机计数5个视野穿膜细胞数。每组设3个平行样本，重复3次。

1.7统计学处理采用SPSS 16.0进行数据处理，各组细胞TWIST、E-cadherin mRNA和蛋白表达，以及穿膜细胞数的比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组细胞TWIST和E-cadherinmRNA的表达见图1、表1。

图1 各组细胞TWIST(上)和E-cadherin(下) mRNA的表达

2.2各组细胞TWIST和E-cadherin蛋白的表达

见图2、表1。

2.3各组细胞体外侵袭能力的比较见表1。

图2 各组细胞TWIST(上)和E-cadherin(下) 蛋白的表达

表1 各组细胞TWIST、E-cadherin mRNA和蛋白的表达以及穿膜细胞数比较

*与空白和阴性对照组比较，P<0.05。

3 讨论

肿瘤侵袭转移的过程涉及多种基因的表达异常，TWIST基因在其中的作用越来越受到重视[4]。TWIST是一种编码位于常染色体上的碱性螺旋-环-螺旋转录因子。TWIST基因最早于1983年在果蝇中被发现，随后在多种生物及人体中也相继发现了该基因的相似结构。TWIST核苷酸高度保守，在小鼠和人类的氨基酸序列具有96%的同源性，并且在不同的种属中其DNA结合区域具有100%的序列保守[5]。Liu等[6]利用RNAi技术沉默MKN45细胞中TWIST基因的表达，发现MKN45细胞体外侵袭能力明显下降；Gong等[7]研究发现在食管癌EC9706细胞中抑制TWIST基因的表达同样可以抑制该细胞的体外侵袭能力。但有关TWIST基因在肝癌侵袭转移中的作用研究较少。该研究结果表明，TWIST基因mRNA和蛋白的表达在TWIST siRNA组明显低于空白和阴性对照组，TWIST siRNA组穿膜细胞数较空白和阴性对照组明显减少， 提示沉默TWIST基因能有效降低SMMC-7721 细胞体外侵袭能力。

恶性肿瘤侵袭转移是一个复杂的多步骤过程，但上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)在其中的起始作用越来越受到国内外学者重视[8]。跨膜蛋白E-cadherin是上皮表型的重要标志，它的表达降低是导致EMT发生至关重要的一步[9]。作者的研究结果显示，TWIST siRNA组E-cadherin mRNA和蛋白的表达较空白和阴性对照组升高。因此推测TWIST可能作为E-cadherin的重要转录抑制因子，通过参与EMT的发生在肝癌的侵袭转移中发挥重要作用。

综上所述，抑制肝癌SMMC-7721细胞TWIST基因表达可能进一步抑制肝癌细胞EMT的发生，同时可有效降低肝癌细胞的侵袭转移能力。下一步作者将进一步实验印证TWIST和E-cadherin在肝癌发生发展中的作用，以期为肝癌的基因治疗提供一定的理论基础和可能的治疗靶点。

[1] 尹锐, 何涛. Twist 基因与乳腺癌的发生和转移[J]. 现代诊断与治疗, 2011, 22( 3): 156

[2] 杨洲, 李小军, 罗婷, 等. TWIST转录因子在胃癌中的表达及临床意义[J]. 四川大学学报：医学版, 2011，42(5):625

[3] 刘晓燕, 王丽, 何涛, 等.Twist 在几种不同肿瘤细胞系中的差异表达[J]. 泸州医学院学报, 2010, 33(2)：128

[4] 李翠香，孙世仁，何丽洁，等.Twist过表达在人腹膜间皮细胞转分化中的作用[J]. 解放军医学杂志，2011,36(5)：456

[5] 董衍东, 何涛. Twist与肿瘤的关系研究进展[J]. 西南军医, 2009， 11(3): 493

[6] Liu AN, Zhu ZH, Chang SJ, et al. Twist expression associated with the epithelial-mesenchymal transition in gastric cancer[J]. Mol Cell Biochem,2012，367(1/2)：195

[7] Gong T, Xue Z, Tang S, et al. Nuclear expression of twist promotes lymphatic metastasis in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Cancer Biol Ther，2012，13(8)： 606

[8] 张华东, 黄勇, 李宏伟, 等. 上皮-间质转化研究进展[J]. 中国现代医学杂志, 2011,21(31): 3907

[9] Xiong H, Hong J, Du W, et al. Roles of STAT3 and ZEB1 proteins in E-cadherin down-regulation and human colorectal cancer epithelial-mesenchymal transition[J]. J Biol Chem,2012,287(8):5819