侵袭性牙周炎患者牙龈组织中MMP-8及TIMP-1的表达*

岳新新，薛 蕊，张 炜，刘 娟，轩东英，章锦才，赵红宇

1)南方医科大学附属口腔医院；广东省口腔医院牙周科 广州 510280 2)郑州大学口腔医学院 郑州 450052 3)南方医科大学附属口腔医院；广东省口腔医院番禺分院牙周科 番禺 511400

牙周疾病是一种慢性炎症导致的感染性疾病，其特点是牙周支持组织的丧失。侵袭性牙周炎(aggressive periodontitis, AgP)具有家族聚集性,发展迅速，是健康年轻患者失牙的主要原因之一。关于AgP的病因和发病机制目前尚无明确定论，但大多数学者倾向于由微生物因素、宿主免疫因素及遗传因素等多因素共同作用所致[1]。来源于宿主的基质金属蛋白酶-8(matrix metalloproteinase-8,MMP-8)，即胶原酶-2，是一种重要的胶原水解酶，在牙周结缔组织和骨组织的破坏过程中起重要作用[2-3]。基质金属蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)通常被认为是MMPs重要的内源性抑制因子[4-5]，在多种类型细胞和组织中均有表达，参与正常牙周组织的改建。MMPs及TIMPs的失衡可能是激活细胞外基质，破坏基底膜细胞和牙槽骨的重要原因[3]。作者应用免疫组织化学方法观察AgP患者牙龈组织中MMP-8 和TIMP-1的表达情况，探讨MMP-8和TIMP-1在 AgP发生发展过程中的作用。

1 对象与方法

1.1研究对象选择2011年5月至2012年2月于广东省口腔医院牙周科就诊的AgP患者和外科就诊的需要进行手术拔除埋伏牙的患者(对照组)。2组人群均符合以下入选条件:①全身无系统性疾病, 妇女非妊娠期, 未服用避孕药，不吸烟。②近1 a内未做过牙周治疗, 3个月内未服用过抗生素。③无明显咬合关系异常, 无正畸治疗史。AgP患者同时亦满足以下条件：发病年龄在35岁以下， 全口至少有6颗患牙探诊深度>5 mm, 邻面附着丧失>3 mm,全口根尖片证实有邻面牙槽骨吸收。根据上述标准，AgP组共15例，男9例, 女6例, 年龄20～37岁，诊断均符合1999年牙周病分类法国际研讨会所制定的标准, 其中2例被诊断为局限型AgP, 其余13例均为广泛型AgP。对照组20例，男12例, 女8例，年龄20～30岁，全口牙周检查探诊深度<3 mm, 无附着丧失, 出血指数>2的位点不超过10%。研究对象均知情同意并签署知情同意书。

1.2临床检查采用Florida探针进行全口牙齿的探查和记录。指标包括菌斑指数(plaque index, PLI)、探诊深度(probing depth, PD)、出血指数(bleeding index, BI)、附着丧失(attachment loss,AL)、松动度以及根分叉病变。牙周炎患者拍摄全口根尖片。

1.3牙龈组织中MMP-8和TIMP-1蛋白的检测

局麻下在患牙唇颊侧牙龈近、远中垂直切至牙周袋底或龈沟底, 另在袋底或沟底行水平切口, 获取牙龈标本。用灭菌生理盐水冲洗后，多聚甲醛固定, 脱水, 透明, 石蜡包埋， 3 μm厚连续切片, 采用多聚赖氨酸防脱片, 60 ℃烤片2 h。采用二步法(无生物素PV6000系列)行免疫组化染色。对组织切片行二甲苯脱蜡, 梯度乙醇脱水后，Tris-EDTA(pH 9.0)抗原修复液微波修复15 min(中低火8 min，低火7 min)，体积分数3%H2O2室温孵育10 min,正常山羊血清室温下孵育30 min,滴加15 mg/L TIMP-1抗体(R&D公司，MAB970)和8 mg/L MMP-8抗体(PL laboratories，PL031913R)，4 ℃孵育过夜。 加非生物素标记的二抗IgG 37 ℃ 孵育15 min。每步骤间均用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)冲洗3次, 每次5 min。DAB显色，苏木素复染,盐酸乙醇分化，脱水，透明，中性树胶封片。以PBS代替一抗作阴性对照。于400倍光镜下，每张切片选择10个有代表性的视野拍摄，应用Image Pro plus图片分析测量软件分析图片，计算平均光密度值，以此代表目的蛋白表达水平。

1.4统计学处理采用SPSS 13.0进行统计分析。因蛋白表达水平不满足正态分布，故采用两独立样本秩和检验。应用ROC曲线分析MMP-8、TIMP-1表达和MMP-8/TIMP-1的诊断价值，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 2组牙龈组织中MMP-8和TIMP-1蛋白的表达见图1和表1。MMP-8和TIMP-1表达于牙龈组织的上皮内及上皮下结缔组织。AgP组MMP-8表达水平及MMP-8/TIMP-1高于对照组，但2组TIMP-1的表达水平差异无统计学意义。

图1 2组牙龈组织中MMP-8 和TIMP-1蛋白的表达(SP，×400)

表1 2组牙龈组织中MMP-8、TIMP-1表达水平和MMP-8/TIMP-1的比较

表内数据为M(P25～P75)。

2.2诊断分析ROC曲线见图2。AUC(MMP-8)=0.752，95%CI=0.618～0.885(P=0.003),有一定诊断价值；AUC(MMP-8/TIMP-1)=0.913，95%CI=0.831～0.996(P<0.001),具有较高诊断价值;AUC(TIMP-1)=0.347，95%CI=0.194～0.499(P=0.068),无诊断价值。MMP-8与MMP-8/TIMP-1的诊断效率见表2。

图2 ROC曲线

表2 MMP-8与MMP-8/TIMP-1的诊断效率

3 讨论

牙周病是人类口腔的两大疾病之一[6]。AgP是一类发病年龄轻、进展迅速且破坏严重的牙周疾病。在牙周组织的破坏过程中，结缔组织的降解和骨组织的破坏主要通过诱导活化宿主细胞内的酶来实现。这些酶中，较为重要的一类是MMPs，它们是降解细胞外基质(包括胶原、蛋白聚糖等细胞外基质成分)的主要酶系，MMPs和其内源性抑制因子TIMPs的失衡可能导致多种疾病的发生或加重疾病的进展[3，7]。MMP-8又被称为中性粒细胞型胶原酶，主要由多形核白细胞产生和分泌，也可由牙龈成纤维细胞、内皮细胞、龈沟上皮细胞、浆细胞和成牙骨质细胞等多种细胞产生。Teles等[8]发现唾液中MMP-8的表达与牙龈出血指数相关。Sorsa等[9-10]发现牙周炎患者的龈沟液中存在大量的MMP-8活化形式，并指出MMP-8可以作为牙周炎的一个生物学诊断指标，但同时Sorsa等指出由于没有统一的实验方法和充足的证据，这种观点又具有一定的局限性。2013年，Gursoy等[11]通过检测牙周炎患者唾液中MMPs及Ⅰ型胶原纤维降解后的终末产物发现，MMP-8是一个可以有效区分重度和轻度牙槽骨吸收及健康人的生物标记物。

TIMP-1是MMPs的重要抑制因子之一，同时也参与了MMPs的运输和稳定[2，12]。TIMP-1在多种细胞类型和组织中均有表达，可由多种牙周细胞分泌，如成纤维细胞、角化细胞、上皮细胞和单核巨噬细胞等炎性细胞。TIMPs通常与MMPs按11形成MMP-TIMP复合体，通过特异性地结合MMPs的活性中心来抑制其活性，参与细胞外基质的生理改建和各种病理过程。活化的MMPs和TIMPs的平衡是细胞外基质稳定的前提条件，二者的失衡将导致一系列的病理改变，在牙周疾病的组织破坏过程中发挥重要作用[13-14]。刘楚峰等[15]证实TIMP-1参与了正畸牙周组织改建过程中Ⅰ型胶原代谢的调节。Sorsa等[9]运用ELISA、免疫荧光染色试剂盒或液相芯片技术分析慢性牙周炎患者的唾液后认为，重度牙周炎患者唾液中MMP-8水平和MMP-8/TIMP-1显著高于正常人群 。Mouzakiti等[16]证明牙周治疗可以显著提高慢性牙周炎患者TIMP-1的表达，降低MMPs/TIMP-1。

该研究发现正常人和AgP患者牙龈组织的上皮内及上皮下结缔组织中均有MMP-8的表达；AgP患者牙龈组织中MMP-8呈强阳性表达，主要表达于改建的结缔组织区，AgP组MMP-8阳性表达率高于对照组，说明MMP-8在AgP发生发展过程中发挥重要作用。但AgP组牙龈组织中TIMP-1的表达与对照组相比差异并无统计学意义，而Gursoy等[10]证实牙周炎患者唾液中TIMP-1水平低于正常。结果的不一致可能是由于研究人群和种族的不同、样本量不足或标本不同造成的。

宿主和(或)微生物来源的生物标记物联合检测可以大大提高疾病的诊断率。Sorsa等[9]指出唾液中MMP-8水平和MMP-8/TIMP-1可以用作牙周疾病大范围普查时的有效诊断指标。该研究结果提示牙龈组织中MMP-8表达水平对AgP有一定的诊断价值，而MMP-8/TIMP-1有较高的诊断价值，TIMP1无明显的诊断意义，与2010年Sorsa等[9]在唾液中的研究结果相符合。

综上所述，MMP-8与AgP发生、发展过程关系密切，MMP-8和MMP-8/TIMP-1可以作为诊断AgP的潜在指标。但MMP-8和TIMP-1与细胞外基质的调控关系较为复杂，二者在AgP中的作用机制，需从分子生物学水平进一步研究。

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