染发剂中4种p-苯二胺N位取代衍生物的高效液相色谱测定法

胡 阳，吴光斌，倪 辉

(集美大学 生物工程学院，福建 厦门 361021)

苯二胺类染发剂是目前应用最广泛的染发剂原料，具有染色效果好、色调变化宽、维持时间长等诸多优点［1］，也是已确认的有害物质，可经皮肤吸收，引起皮疹和使肝脏受损害，吸入粉尘可引起过敏、鼻炎、支气管炎、发烧等不同病症，经常染发或职业上使用含苯二胺类染发剂的人，其膀胱癌、皮肤癌和淋巴瘤患病率显著高于常人［2－5］。p-苯二胺N位取代衍生物是染发剂中常见的染料，在化妆品中属于严格禁限用物质。Jean-Luc等［6］证实p-苯二胺及其N-乙酰基和N，N-双乙酰基取代物对人体有遗传毒性。我国《化妆品卫生标准》(GB7916－87)［7］和《化妆品卫生规范》(2007年版)［8］对其作了严格的限量要求，规定该4种染料成分最大不超过6.0%。

针对种类繁多的染料成分，各国科学家一直在积极研究新的检测方法以适应不断增加的染发剂检测要求，已有方法主要包括薄层色谱［9］、高效液相色谱(HPLC)［10－11］、液相色谱 －质谱(HPLCMS)［12］、气相色谱(GC)［13］、气相色谱 － 质谱(GC － MS)［14］、毛细管电泳［15］等。苯二胺类染料成分具有极性强、挥发性低及不稳定的特点，HPLC是较理想的检测方法。Axel等［16］使用HPLC/DAD和ECD检测生物样品中的p-苯二胺及其衍生物N-乙酰基-p-苯二胺和N，N-双乙酰基-p-苯二胺，于文莲等［17］采用液相色谱法对染发剂中5种N-氨基N-硝基苯酚的同分异构体进行同时测定，但目前国内外针对染发剂中多种p-苯二胺N位衍生物的分析研究较少。本文建立了染发剂中N，N-双(2-羟乙基)-p-苯二胺硫酸盐(DHPD)、N，N-二甲基-p-苯二胺硫酸盐(DMPD)、N，N-二乙基-p-苯二胺硫酸盐(DEPD)、N-苯基-p-苯二胺盐酸盐(PPD)4种p-苯二胺N位衍生物的高效液相色谱检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters 1525高效液相色谱仪，配紫外检测器(美国Waters);PH211型pH计(意大利Hanna);KQ-250E型超声波提取器(昆山市超声仪器有限公司);EL104型电子天平(瑞士Mettler-Toledo，感量0.1 mg);5415D型离心机(德国Eppendorf);0.45 μm有机滤膜。

标准物质(纯度≥98%):N，N-双(2-羟乙基)-p-苯二胺硫酸盐、N，N-二甲基-p-苯二胺硫酸盐、N，N-二乙基-p-苯二胺硫酸盐、N-苯基-p-苯二胺盐酸盐均购自日本东京化成公司。

乙腈(美国天地公司)、辛烷磺酸钠(美国Sigma公司)均为色谱纯;亚硫酸钠、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、乙醇均为分析纯。

1.2 实验步骤

1.2.1 溶液配制 25 mmol/L磷酸盐缓冲液体系:称取十二水合磷酸氢二钠0.958 g、磷酸二氢钾3.06 g、辛烷磺酸钠1.0 g溶于约900 mL超纯水中，磷酸调节pH值至6.0，最后定容至1 000 mL，经过0.45 μm滤膜过滤;1%亚硫酸钠溶液:称取1.0 g亚硫酸钠溶于约90 mL超纯水中，定容至100 mL;单一标准储备液:准确称取62.5 mg N，N-双(2-羟乙基)-p-苯二胺硫酸盐、N，N-二甲基-p-苯二胺硫酸盐、N，N-二乙基-p-苯二胺硫酸盐、N-苯基-p-苯二胺盐酸盐4种标准品，各加入25 mg亚硫酸钠，用乙醇水溶液(50%)定容至25 mL容量瓶中，混匀。该溶液的浓度为2.5 g/L，－18℃保存一周;混合标准工作溶液:分别移取适量的各单一标准储备液，用乙醇－水溶液稀释成浓度为0.5、1、5、50、100、200、400 mg/L的混合标准溶液。

1.2.2 样品处理 准确称取0.5 g样品(精确至0.000 1 g)，置于50 mL容量瓶中，加入约10 mL 50%乙醇水溶液，使样品完全溶解，然后加入1 mL 1%的亚硫酸钠，用50%乙醇水溶液定容。涡旋混合后超声提取15 min，转移至离心管以4 000 r/min离心5 min，取上清液并过0.45 μm有机滤膜后进行高效液相色谱检测。

1.3 液相色谱条件

色谱柱:Agilent Eclipse XDB－C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm，美国Agilent公司);流动相:A相为25 mmol/L磷酸缓冲液体系(pH 6.0，含0.1%的辛烷磺酸钠)，B相为乙腈;梯度洗脱:0～5 min，5%～30%B，5～9 min，30%～40%B，9～13 min，40%～90%B，13～15 min，90%～5%B，15～25 min，5%B。流速:1.0 mL/min;柱温25℃;进样量:20 μL;检测波长:250、280 nm。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理

本方法采用50%乙醇水溶液超声波提取，由于染料中间体极易氧化变质，因此在提取过程中加入1 mL 1%的亚硫酸钠溶液作为还原剂以提高染料的回收率。样品无需净化，即采用提取液离心去沉淀并过滤后直接进样，方法简便、快速。

2.2 液相色谱条件的选择

2.2.1 检测波长的选择 采用紫外分光光度计对4种目标物进行紫外区波长扫描，得到其紫外吸收光谱图(见图1)。由各物质的紫外吸收光谱可知，N，N-双(2-羟乙基)-p-苯二胺硫酸盐、N，N-二甲基-p-苯二胺硫酸盐、N，N-二乙基-p-苯二胺硫酸盐在250 nm有特征吸收，N-苯基-p-苯二胺盐酸盐在280 nm有特征吸收，因此实验选用250 nm和280 nm作为定量检测波长。

图1 4种p-苯二胺N位取代衍生物标准品的紫外吸收光谱图Fig.1 UV spectra of four N-substituted derivatives standards

2.2.2 色谱柱的选择 相关研究表明使用C8柱分离染发剂中的染料成分效果不佳［10］，因此实验选用普通C18与普通C16柱进行分离效果的比较，结果显示待测组分在两种色谱柱上的保留无明显差异，考虑到色谱柱的适用性，选择普通C18柱对待测物进行分离。

2.2.3 流动相体系的选择 考虑到样品中的其它苯二胺类物质对待测4种染料成分分离的影响，根据实际样品基质的干扰情况对流动相比例及梯度进行了优化。实验研究了不同溶剂、pH值及离子对试剂对分离效果的影响。考察了水－甲醇、水－乙腈、磷酸盐缓冲液体系－甲醇(用NaOH调至pH 6.0、6.5、7.0)、磷酸盐缓冲液体系－乙腈(用NaOH调至pH 6.0、6.5、7.0)、磷酸盐缓冲液体系－乙腈(用NaOH调至pH 6.0、6.5、7.0，含0.1%的辛烷磺酸钠)5种流动相体系对实验的影响，结果表明采用乙腈作为有机相较甲醇能获得更好的峰形及保留;采用pH 6.0的流动相时，各目标物的分离效果最优;采用添加辛烷磺酸钠的离子对试剂可以改善峰形，使4种目标物在20 min内得到良好分离，且重现性较好。因此实验最终选择磷酸盐缓冲液体系－乙腈(用NaOH调至pH 6.0，含0.1%的辛烷磺酸钠)作为最佳流动相。

由于等度洗脱难以将4种目标物与样品中的其它染料成分有效分离。因此采用梯度洗脱，当磷酸盐缓冲液体系－乙腈的体积比为95∶5时，可将N，N-双(2-羟乙基)-p-苯二胺硫酸盐与样品中其它复杂的染料成分完全分离;缓慢增加乙腈的比例，可使较难分离的N，N-二甲基-p-苯二胺硫酸盐和N，N-二乙基-p-苯二胺硫酸盐得到有效分离;N-苯基-p-苯二胺盐酸盐的出峰时间较晚，可通过提高乙腈比例使其快速出峰。优化的流动相梯度洗脱条件如“1.3”所述。

2.2.4 柱温的选择 考虑到温度对氧化型染料成分有一定的影响，因此选择25℃作为检测温度，既可保证保留时间的稳定性，又可排除温度对4种目标物的影响。

在上述优化的液相色谱条件下对标准品和实际样品进行测定，4种染料成分标准品及样品的液相色谱图见图2。由图可见，4种目标物在20 min内得到良好分离，且峰形对称，能达到基线分离。

2.3 标准曲线、线性范围与检出限

在优化实验条件下，对不同质量浓度的4种染料标准品进行测定，结果显示，4种染料的质量浓度在0.1～400 mg/L范围内与其响应值呈良好的线性关系，其相关系数r为0.999 2～0.999 9。分别以S/N=3和S/N=10计算方法的检出限与定量下限(见表1)。结果显示，方法的检出限为18～108 mg·kg－1，定量下限为42～320 mg·kg－1，完全满足国家标准对染发剂的检测要求。

图2 4种p-苯二胺N位取代衍生物标准品(A)及染发剂样品(B)的色谱图Fig.2 HPLC of four dye standards(A)and four dye samples(B)peak identifications:1.DHPD;2.DMPD;3.DEPD;4.PPD

表1 4种p-苯二胺N位取代衍生物的标准曲线、线性范围、检出限及定量下限Table 1 Regression equations，correlation coefficients，limits of detection(LODs)and limits of quantitation(LOQs)for four dye standards

2.4 回收率与精密度

选择染发剂5号样品(4种p-苯二胺N位取代衍生物均未检出)，在所确定的定量下限基础上添加3个不同水平的标准品，进行多水平的加标回收率实验，每个加标水平平行测定6次，计算其回收率和相对标准偏差(见表2)。结果表明，4种染料成分的加标回收率为83%～115%，相对标准偏差(RSD)均小于10%，说明该检测方法的准确度好、精密度高。

表2 4种p-苯二胺N位取代衍生物在染发剂样品中的加标回收率及相对标准偏差(n=6)Table 2 Average recoveries and RSDs of four dye standards(n=6)

2.5 实际样品的测定

利用本方法测定了6种市售染发剂中4种N位取代衍生物的含量(以盐的形式计)，结果见表3。所测的6种样品中，均未检出N，N-双(2-羟乙基)-p-苯二胺硫酸盐和N，N-二乙基-p-苯二胺硫酸盐，只有6号样品棕黑色染发剂检出N，N-二甲基-p-苯二胺硫酸盐;此外，除5号样品外，其余样品均检出了N-苯基-p-苯二胺盐酸盐。

表3 市售部分染发剂中p-苯二胺N位取代衍生物含量普查结果Table 3 Detection results of some hair dyes saled in market w/(mg·kg－1)

3 结论

本文针对4种染发剂中的p-苯二胺N位衍生物建立了高效液相色谱检测方法，该方法精密度好、回收率高、简便、快速、准确，可用于染发剂中N，N-双(2-羟乙基)-p-苯二胺硫酸盐、N，N-二甲基-p-苯二胺硫酸盐、N，N-二乙基-p-苯二胺硫酸盐、N-苯基-p-苯二胺盐酸盐的测定。

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