五倍子没食子酸研究进展

张雅丽，李建科，刘 柳，于 振，马倩倩，李梦颖

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710062）

五倍子（Galla Chinensis）别名百虫仓、文蛤，为瘿绵蚜科（Pemphigidae）的一些蚜虫寄生在漆树科盐肤木属植物的叶上形成的囊状虫瘿。五倍子是我国传统中药，最早记载于《开宝本草》[1]，具有敛肺降火、敛汗、止血等功效[2]，含有单宁、没食子酸、五倍子油等成分，其中单宁可高达80%[3]。我国是五倍子的主要生产国家，在世界总产量中占95%左右；我国五倍子不仅产量大，而且品质高，主产区集中在贵州、陕西、四川、云南等省[4-5]。没食子酸（Gallic acid）是五倍子的主成分之一，约占2%～4%，是一种天然的多酚类化合物，具有抗氧化、抑菌、防龋齿等生物活性[6]。我国五倍子所含的单宁属于水解单宁[7]，工业上通过水解五倍子单宁获得没食子酸，可用于医药、有机合成和食品、农业、矿产等领域，并作为商品出口，具有很大的应用价值。本文将就五倍子没食子酸的制备、测定方法、生物活性等进行综述。

1 没食子酸的理化性质

没食子酸（Gallic acid）化学名称为3，4，5-三羟基苯甲酸，分子式为C7H6O5，分子量为170.12，其结构式如图1所示，通常以一水合物的状态存在，是白色或微黄色针状晶体，常温时（25℃）微溶于水，易溶于沸水、乙醚、丙酮等，不溶于氯仿、苯等有机溶剂。没食子酸具有强还原性，遇空气中的氧变成褐色，还可与蛋白质、凝胶、重金属、生物碱等结合[8]。它是植物体中一类次生代谢产物，以游离酸或形成酯类化合物的形式存在于五倍子、茶、没食子等植物中，属于低毒物质[9]。经由没食子酸生成的没食子酸丙酯、次没食子酸铋等多种衍生物，可用于食品、制药及轻工等行业[10]。

图1 没食子酸结构式Fig.1 The structure of Gallic acid

2 没食子酸的制备

图2 五倍子单宁水解生产没食子酸反应式Fig.2 Hydrolysis Equation of Gallic acid from Galla Chinensis

五倍子单宁由没食子酸、双倍酸与葡萄糖以酯或甙的形式结合，可在酸、碱等作用下水解生成没食子酸，制备过程如图2所示。

通过五倍子生产没食子酸的途径有化学法和生物法。化学法包括酸水解法和碱水解法，生物法包括酶法和发酵法[11]。五倍子单宁在完全水解的情况下，可生成7～9分子的没食子酸。

2.1 酸水解法

酸水解法，是五倍子单宁浸提液在加热的条件下，以酸为催化剂进行的催化反应。此时一分子单宁与n分子的水反应，生成一分子葡萄糖和n分子（n为6、7、8）没食子酸。

王广娟[12]以五倍子生品为原料，考察了温度、酸度、时间以及料液比等因素对提取没食子酸影响的大小，发现酸度及时间对结果有显著的影响，在经正交优化后所得最佳提取条件为温度100℃，盐酸浓度4mol/mL，时间3h，料液比1∶80，此时没食子酸得率为56.3%。瞿燕[13]考察了五倍子酸解时所用酸种类，选取硫酸和盐酸作为研究因素，没食子酸得率分别为18.75%、18.40%；虽然两者无显著差异，但因为盐酸易挥发，所以选择盐酸。韦国锋等[14]改进酸水解工艺，取消了制冷设备，不仅缩短生产周期、减少费用，而且在新工艺下没食子酸提取率可达14.8%以上。

在工业化生产中，酸解法使用时间长、经验多，但由于单宁不能完全水解，没食子酸收率较低，对含单宁低的五倍子原料不能利用；反应过程所使用的酸，对设备腐蚀大，缩短了使用寿命，加速了折旧进程；并且所产生的葡萄糖，在长时间的酸性和高温环境下可生成色素物质5’-羟甲基糖醛，需用活性炭进一步脱色，由此生成的废液会污染环境[15]。

2.2 碱水解法

碱水解法，是五倍子单宁浸提液在碱性条件下水解，再用酸中和、酸化进而生成没食子酸的过程。

黄嘉玲等[16]通过碱水解法获得了制备高收率、高质量的没食子酸的最优工艺，并在质量上主要解决了五倍子提取物水解产物在颜色上的问题，此时没食子酸质量分数及颜色都符合出口标准，并为进一步扩大生产及工业化提供了依据。相对于酸水解法，碱水解法反应时间短，对设备腐蚀小，延长了设备的寿命，陈茜文等[17]又进一步以五倍子单宁酸为研究对象，考察了水解时反应温度、时间和碱液浓度对没食子酸得率的影响，并且通过正交实验和极差分析获得最优条件为单宁酸与氢氧化钠物质的量比为1∶38，时间100min，温度106℃，此时得率达到48.3%，增加了5%～6%，并且产物中没有絮状物质。但是从单宁化学性质上分析，单宁在碱性环境中易被氧化。陈笳鸿等[18]发现延长碱水解法中反应时间会使得率降低，去氧保护会增加实际生产中的难度。因此应适当缩短碱水解时间，减少单宁氧化的不利影响。并且碱水解法工艺过程比较复杂，也会产生色素物质，需进一步脱色，增加成本，生成的废液同样污染环境[19]。

2.3 酶法

酶法的关键是筛选、获得活力高的单宁酶。单宁酶（Tannase，EC3.1.1.20）为酰基水解酶，是诱导型胞外酶，可高效、定向裂解单宁中的酯键、糖苷键和缩酚酸键[20-21]。单宁酶主要由真菌产生，如曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）微生物，特别是曲霉属中的黑曲霉（Aspergillus niger）[22]。五倍子单宁可在单宁酶的作用下水解生成没食子酸[23]。

王啸等[24]先以五倍子固体和黑曲霉B0201发酵生产单宁酶，再用酶法制备没食子酸；反应4h时，100mL单宁酶酶液中生成了0.77g没食子酸，建立了一种黑曲霉单宁酶两步法制备没食子酸的工艺。郭鲁宏等[25]以海藻酸钙为载体，包埋黑曲霉单宁酶，研究了固定化条件和固定化单宁酶的一些性质，并在最优条件下利用固定化酶进行了没食子酸克量级制备实验，产品平均得率为61%，具有潜在的开发价值。张楚晗等[26]直接以单宁酶与五倍子作用，4h后没食子酸产量比空白组高6倍左右，但是不同单宁酶用量间的没食子酸得率差别不大。

酶法与化学水解法相比，其特点是底物水解完全，原料利用率高，反应时间短，并且可在常压下进行，所需条件温和，能量消耗低，对环境污染小[23]。但生产单宁酶的费用昂贵[27]。

2.4 发酵法

发酵法是利用微生物在含单宁的溶液中发酵，而微生物经诱导产生单宁酶，进一步对单宁进行水解生成没食子酸过程。

杨亚力等[28]将筛选到的两株具有高单宁酶活性的黑曲霉菌株接种于含有五倍子单宁的液体中，利用发酵程序，在反应48h后没食子酸的质量浓度分别达到20.6mg/mL和21.3mg/mL，具有很好的工业开发前景。胡昌江等[29]在以五倍子为原料，选以酵曲量、茶叶量和发酵时间为研究对象，并在最佳发酵工艺下，发酵72h后，没食子酸的量只达到26.75%。F议Regerat等[30]发现发酵培养基的种类可影响发酵开始的时间，五倍子浸提液培养基比五倍子生料培养基开始发酵的时间早。王蔚文等[31]通过实验室扩大实验，使用的发酵罐容积为20L，种量为10%，发酵5～6天后，没食子酸的得率为五倍子原料的40%。

虽然发酵法能耗低，废液对环境污染小，但存在的主要问题是酶的生成和单宁的水解在同一个容器中发生，反应条件不能达到最佳状态，导致单宁水解不完全，反应时间增长[19]。

综上所述，化学法（酸水解法和碱水解法）都具有反应时间短的特点，但是单宁均不能完全水解，没食子酸得率较低，生成的废液污染环境，并且酸水解法严重腐蚀设备。酶法和发酵法具有能耗低，废液对环境污染小，没食子酸的转化率高的特点，其中酶法在4种方法中转化率最高；但两者反应时间相对较长，其中发酵法在4种方法中反应时间最长，并且酶法中所使用的单宁酶费用高。

3 没食子酸的纯化

没食子酸是3，4，5-三羟基苯甲酸，其羧基和羟基是对位关系，性质相对稳定，可溶于乙醇、丙酮、乙醚和热水中，不溶于苯、三氯甲烷等有机溶剂。可通过溶剂萃取法、超滤技术、树脂法、双水相萃取技术等对没食子酸进行纯化处理，而且传统方法与新型方法在工艺流程、所得产品纯度上均不同。

陈立宇等[32]采用溶剂萃取没食子酸，研究了萃取剂的种类、浓度以及萃取的温度、时间对萃取效果的影响，在所选取的萃取剂中，100%丁醇具有良好的萃取效果，一级萃取率为90%；并且丁醇价格便宜，供给丰裕，成本低。王广娟等[33]又利用树脂分离并纯化五倍子中的没食子酸，结果显示D301型离子交换树脂能更好的纯化没食子酸。在上样质量浓度3.316mg/mL，上样液体积12BV，速率1mL/min时，树脂处于动态饱和吸附状态。再以18BV 70%乙醇，1mL/min的速率可完全洗脱。经树脂纯化后，没食子酸的纯度由先前的42.4%增长到68.8%。离子交换树脂不仅操作方便，可连续化生产，并且获得的成品纯度高，但需要在最佳条件下才能达到最优效果。

4 没食子酸的测定方法

4.1 高效液相色谱法

高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）又称高速液相色谱，它以液体作为流动相，根据各种溶质在色谱柱中不同的迁移速度而达到分离、分析的目的。

侯惠婵等[34]建立了用高效液相色谱法来测定五倍子中没食子酸的量，色谱柱为DiamonsilTMC18（200mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈-0.5%磷酸溶液（3∶97），没食子酸在0.1～1μg范围内呈现良好的线性关系，r2=0.9999，RSD=1.9%（n=6），所测样品1（角倍）中没食子酸为1.88%。李宁等[35]也建立了高效液相色谱法测定五倍子没食子酸的量，以phenomenex Luna 5μ C18（2）100A为色谱柱，甲醇-0.1%磷酸溶液（7∶93）为流动相，测得没食子酸在0.082～0.818μg有良好的线性关系，r=0.9999，RSD=1.68%（n=9）。由于高效液相色谱法中各种测定条件，如色谱柱与流动类型、流速、检测波长等，都可影响测定结果[36]，因此两者所得最低检测限不同，后者比前者低，可用于没食子酸含量更低的样品。

4.2 薄层扫描法

薄层扫描法（Thin-Layer Chromatography，TLC）指用一定波长的光照射到薄层上，对薄层色谱中有紫外或可见吸收的斑点或经照射能激发产生荧光的斑点进行扫描，进而进行定性定量分析[37]。

郭耀武等[38]探讨以薄层扫描法测定五倍子中没食子酸的量，采用50%乙醇为展开剂，0.5%三氯化铁乙醇溶液为显色剂，得到没食子酸线性范围为0.426～2.98μg，所测样品中没食子酸含量为3.5%～8.0%。刘新平等[39]采用薄层扫描法对倍芪腹泻贴中五倍子主要成分没食子酸的量进行测定，以36%醋酸为展开剂，0.5%三氯化铁乙醇溶液为显色剂，展开后只显示一个斑点，没有其他干扰，所得没食子酸线性范围为0.604～1.398μg。乔蓉霞等[40]在测定齿痛膜中五倍子主要成分没食子酸含量时，以甲苯-醋酸乙醋-甲酸（8∶4∶1）为展开剂，0.1%三氯化铁/乙醇溶液为显色剂，展开后的斑点清楚干扰小，所得没食子酸线性范围为0.262～2.62μg，样品981001中没食子酸含量为13.22mg/g。由于三者所使用的检测条件有差异，因此所得没食子酸检测限不同，但都简单便捷、重复性高。

4.3 毛细管电泳法

毛细管电泳法（Capillary Electrophoresis，CE），是一类以毛细管为分离通道，高压直流电场为驱动力，样品的多种特性（电荷、大小等）为根据的液相微分离分析技术[36]，主要包括毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳等，是近年来发展十分迅速的一种技术。

瞿海云等[41]探讨了毛细管电泳高频电导法测定五倍子没食子酸的方法，考察了缓冲液、分离电压等因素对分离测定的影响，并可在5.5min内完成没食子酸的测定，检出限达1.0μg/mL。丁华等[42]采用毛细管区带电泳法（capillary zone electrophoresis，CZE）测定石明止血合剂中石榴皮、五倍子的主要有效成分没食子酸的量，该方法操作简单，最低检测质量浓度为1.0μg/mL。付绍平等[43]同样采用毛细管区带电泳法测定没食子酸量，其最低检出限为3.0μg/mL，比上述两种方法的检出限高，这可能是由于运行缓冲液、电压等检测条件不同而导致的差异。

以上3种测定方法虽都简便快捷、重复性好，但又有各自的特点。高效液相色谱法可用于测定热稳定性差或挥发性低的样品，薄层扫描法可对没食子酸进行快速定性分析，毛细管电泳法可用于微量样品的测定。

5 没食子酸的生物活性

5.1 抗氧化作用

机体内的内源或外源性自由基可使氧分子产生氧自由基，氧自由基可引发细胞内外很多化合物的相互作用，导致蛋白质、核酸等损伤[44]，进而引发机体病变[45]。因此，为保护机体免受自由基所造成的损伤，自由基清除剂显得尤为重要[46]。五倍子没食子酸含有较多邻位酚羟基，可释放氢与周围的自由基结合，从而阻止自由基引起的连锁反应，抑制氧化反应的进行，具有较强的抗氧化和捕捉自由基的能力。

于敏等[47]研究了五倍子多酚类物质清除活性氧自由基的效果。通过采用电子自旋共振（（electron spin resonance，ESR）方法和电子自旋捕集技术，分别测定了不同质量浓度的五倍子水提物和醇提物清除DPPH自由基的效果，证明五倍子多酚类物质具有较好的抗氧化性能。代斌[48]研究了五倍子多酚提取物的抗氧化作用。在体外抗氧化实验中，五倍子多酚提取物可有效清除超氧阴离子自由基、DPPH自由基和羟自由基；其对O2-·的清除效果略低于VC对照组，但对DPPH·的清除效果高于VC对照组；对·OH的清除效果高于D-甘露醇，当两者质量浓度同为0.25mg/mL，五倍子多酚提取物的清除率为58.03%，而D-甘露醇为13.56%；此外还可抑制由Fe2+引发的脂质过氧化反应，并表现出较强的还原能力，具有良好的剂量依赖关系。在线粒体抗氧化实验中，五倍子多酚提取物可使膜内外渗透压保持稳定，线粒体的肿胀速率减小，并可使蛋白质羰基的量降低，ATP酶酶活恢复，有保护生物膜的功能。

5.2 抗病毒作用

李红霞[49]在研究五倍子乙醇提取物对烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）的抑制作用时，发现其有效成分中抗病毒作用最强的是没食子酸。通过实时定量RT-PCR反转录合成病毒核酸发现，没食子酸在一定程度上对病毒核酸的生成起到抑制作用；通过测定外壳蛋白亚基发现，没食子酸也在一定程度上影响病毒外壳蛋白在体外的聚合。结果显示，没食子酸可妨碍烟草花叶病毒的正常组装程序，并可有效的抑制病毒的复制。

病毒通过黏附宿主细胞从而进入其内，并合成和翻译信使RNA，进而复制病毒DNA或RNA，最终形成新的病毒。抗病毒物质主要通过抑制逆转录酶、蛋白酶等关键点来发挥作用，而对病毒与宿主细胞和机体间的关系以及更多抗病毒关键位点有待进一步的研究[50]。在日常生活中，病毒性疾病一直是困扰人们的重大问题。目前，一些常用抗病毒药物，如核苷类、生物类药物，均可对机体造成一定损害。因此，具有抗病毒活性的天然化合物（如多酚类物质）炙手可热。并且随着分离、纯化技术的进一步发展，以及各种生物技术的应用，对天然抗病毒活性成分的研究将越来越受到关注。

5.3 抑菌作用

食品作为人类生存的基础物质，并且随着社会经济发展、生活水平的提高，人们越来越重视对食源性致病菌的控制。食品中常见致病菌有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌、空肠弯曲杆菌等，可引起恶心、头痛、呕吐、腹泻等[51-52]。由于人们对化学合成抑菌剂的安全的质疑，安全、绿色、天然的抑菌剂倍受关注。许多植物都可产生具有抑菌作用的次级代谢产物[53]，因而从植物中获得具有抑菌作用的物质成为发展天然抑菌剂的重要渠道。

郑曙明等[6]在研究渔用抗菌剂复方五倍子有效成分及体外抑菌实验时，通过薄层分析法发现并得出五倍子中所含的没食子酸具有较好的抑菌活性。经紫外分光光度法测定其量为10.47%，在活性成分中所占比例最大。并测定了其对水产生物常见致病菌柱状黄杆菌、温和气单胞菌、迟缓爱德华菌、豚鼠气单胞菌的抑菌圈大小，直径分别为26、28、30、25mm，由此可见没食子酸是具有明显抑菌活性的。

5.4 防龋齿的功能

龋齿是指牙齿在多种因素作用下，使组织脱矿、有机质分解等，进而导致牙齿损坏的常见口腔疾病[54]。引起龋齿的主要因素是细菌，如乳酸杆菌、茸毛链球菌、变形链球菌，它们经由附着于牙齿表面，产生牙菌斑，致使牙齿破坏。由此可见，抑制或杀死致龋细菌是预防龋齿的有效途径。

王人可等[55]采用大鼠龋模型，以含有没食子酸的五倍子提取物为实验组，研究了抑龋作用。通过S.sobrinus侵染SPF-SD大鼠建立模型，在对光滑面E级损坏上，与阴性对照组（去离子水）相比，实验组和阳性对照组（洗必泰和氟化钠）都表现了较好的抑制作用（抑龋率为43%～61%，p＜0.05），可能是阻碍了致龋菌黏附在被唾液包裹的羟磷灰石上。谢倩等[56]在研究由五倍子总鞣质分离得到的4个组分对致龋菌生长的影响时发现，五倍子没食子酸具有抑制作用，并通过活菌计数法测定了五倍子没食子酸对变形链球菌生长的影响，结果显示其具有抑制作用，但不能直接杀死细菌，可能是遏制了细菌代谢时需要的酶类的生成。此外，还有研究显示五倍子没食子酸对牙齿脱矿釉质再矿化具有促进作用[57]，这些都将为发展新的防龋活性成分奠定基础，但其在临床中的抑龋效果还需进一步研究。

常用的防龋药物，如抗生素类、氟化物，在长时间使用的情况下，可引起口腔菌群失调或产生耐氟菌、毒副作用等，而五倍子等天然物质不仅治疗效果明显、副作用小，并且资源丰富、获取便利，具有很好的研究价值。

6 展望

没食子酸作为一种天然多酚类物质，可由五倍子单宁水解生成。五倍子作为我国的天然产物，不仅产量大，而且价格低廉，为没食子酸的生产奠定良好的基础。可根据生态工程建设，大力发展这种天然产物资源，其前景是不言而喻的，定会获得良好的社会及经济效益。随着社会和科技的发展，对没食子酸的需求会越来越大。但是，对于没食子酸的各种生物活性（如抗氧化、抑菌等）的作用机制的研究还处于浅显层面，应加大在分子和细胞水平的研究，使其产生更大的作用，拥有更广阔的发展空间。

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