通心络胶囊对糖尿病视网膜病变KK/Upj-Ay小鼠血液及视网膜炎性因子表达的影响

王 超，邢邯英，王 杏，刘 敏，张 哲

糖尿病视网膜病变(DR)是临床2型糖尿病患者常见的微血管病变并发症之一，是一种具有特异性改变的眼底病变，其发病率呈逐年上升趋势[1]。DR发生的确切机制仍未明确，有研究表明持续性高血糖、氧化应激、炎性反应、细胞凋亡、血-视网膜屏障受损等因素均会引起DR的病理生理变化；大量文献报道了炎症在DR生成中占有重要地位，随后的研究也确定了DR是一种“炎症疾病”[2]。肿瘤坏死因子α(TNF-α)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)、白介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)等多种炎性因子含量在 DR患者玻璃体、房水、血清中增加，它们之间的相互作用影响了DR疾病的发生发展。本实验采用自发性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠作为DR小鼠模型，观察通心络胶囊对KK/Upj-Ay小鼠血清及视网膜炎性因子表达的影响，为临床治疗糖尿病微血管病变提供新的用药选择。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 自发性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠40只，12周龄，雄性，30～40 g；C57BL/6小鼠10只，12周龄，雄性，25～30 g。均购于北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证号：SCXK-(京)2009-0002。

1.1.2 药物、试剂与仪器 通心络胶囊购于石家庄以岭药业股份有限公司。TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β一抗购于Abcam公司。7300 Real-Time PCR System仪购于ABI公司；Biorad凝胶成像分析仪购于Biorad公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分组 按KK/Upj-Ay小鼠空腹血糖(FBG)水平从低到高排列，然后按照随机数字表法，将小鼠分为模型组、通心络低剂组、通心络中剂组、通心络高剂组，保证各组小鼠平均FBG水平间无差异；另设C57BL/6小鼠为对照组，每组10只小鼠。各组小鼠灌胃给药，通心络低剂组、通心络中剂组、通心络高剂组小鼠分别给予1、2、4 g生药/kg的通心络胶囊，对照组和模型组小鼠灌胃等体积的蒸馏水，1次/d。各组小鼠自由饮食饮水，连续12周。

1.2.2 体质量及FBG测定 每月记录1次小鼠体质量。实验结束后从小鼠眼球取血，测定FBG水平。

1.2.3 血-视网膜屏障功能测定 给药结束，每组取6只小鼠，尾静脉注射50 mg/kg伊文思蓝(EB)溶液。2 h后麻醉小鼠，灌注4%多聚甲醛缓冲液，灌注压力为80 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)。灌注4 min后摘除眼球，分离视网膜，称量。将视网膜放入150 μl甲酰胺溶液，37 ℃孵育12 h，3 000 r/min 离心(离心半径13.5 cm)10 min，取上清液置96孔酶标板，620 nm处测定光密度(OD)。通过比色法测定EB的含量(单位为ng/mg)，从而反映血-视网膜屏障功能。

1.2.4 视网膜形态学观察 实验结束，快速取小鼠眼球，用甲醛固定，脱水切片，HE染色，光镜下观察形态学。

1.2.5 流式细胞仪检测小鼠全血中炎性因子水平 每组取3只小鼠全血，分离外周血单个核细胞，加入(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸盐(PMA)和离子霉素刺激淋巴细胞，应用流式细胞仪检测细胞，Exp32软件获取分析细胞。每个检测获取10 000个细胞，分析TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β的表达。

1.2.6 Real time PCR测定小鼠视网膜炎性因子mRNA的表达 取小鼠视网膜，常规方法提取组织RNA，鉴定，按试剂盒说明书进行Real Time PCR扩增，以GAPDH作为内参照。TNF-α引物：上游5′- CCACCACGCTCTTCTGTCTA -3′，下游5′-GGCAGCCTTGTCCCTTGAA-3′，产物片段315 bp；IL-6引物：上游5′-GTTGCCTTCTTGGGACTGATG-3′，下游5′- CCTTAGCCACTCCTTCTGTGAC -3′，产物片段525 bp；ICAM-1引物：上游5′- TTCCGCTACCATCACCGTGT -3′，下游5′-AGGTCCTTGCCTACTTGCTG -3′，产物片段84 bp；IL-1β引物：上游5′-AGCCCATCCTCTGTGACTCA-3′，下游5′- TTTGTTGTTCATCTCGGAGCC-3′，产物片段99 bp；GAPDH引物：上游5′-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3′，下游5′-TGCTGAGTATGTCG TGGAGTC-3′，产物片段143 bp。用仪器自带软件分析，将对照组设置为1，与对照组进行比较后的相对定量值为目的基因表达。

1.2.7 蛋白质印迹法(Western blotting)检测小鼠视网膜炎性因子蛋白的表达 每组取3只小鼠的视网膜，加裂解液提取视网膜组织蛋白，加入稀释合适浓度的TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β抗体，化学发光法显色。以β-actin作为内参，扫描后对条带进行吸光度积分分析，以目的蛋白吸光度值/β-actin吸光度值的比值为目的蛋白表达。

2 结果

2.1 各组小鼠体质量及FBG的变化 给药前，模型组及通心络各剂量组小鼠体质量及FBG水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；给药后12周，模型组及通心络各剂量组小鼠体质量及FBG水平仍高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；虽然给药后12周，通心络各剂量组小鼠体质量及FBG水平较模型组有下降的趋势，但组间比较差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。

2.2 各组小鼠给药后12周视网膜EB含量比较 给药后12周，各组小鼠视网膜EB含量比较，差异有统计学意义(P<0.01)；其中模型组及通心络低剂组小鼠视网膜EB含量高于对照组，通心络中、高剂组小鼠视网膜EB含量低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

Table1 Comparison of the body weights and FBG levels among various groups of mice before treatment and 12 weeks after treatment

组别只数体质量(g) 给药前 给药后12周FBG(mmol/L) 给药前 给药后12周对照组10252±10305±2853±0855±09模型组10344±20∗460±22∗148±27∗175±28∗通心络低剂组10350±20∗444±34∗147±28∗165±24∗通心络中剂组10348±30∗443±20∗146±26∗158±19∗通心络高剂组10349±19∗434±38∗149±23∗150±23∗F值4346489132455160P值000000000000

注：FBG=空腹血糖；与对照组比较，*P<0.01

Table2 Comparison of EB content in retina among various of groups of mice 12 weeks after treatment

组别只数EB对照组6126±26模型组6255±36△通心络低剂组6208±39∗通心络中剂组6164±26▲通心络高剂组6161±24▲F值1567P值000

注：EB=伊文思蓝；与对照组比较，*P<0.05，△P<0.01；与模型组比较，▲P<0.01

2.3 各组小鼠给药后12周视网膜形态学变化 给药后12周，光镜下观察到对照组小鼠视网膜色素上皮层，视锥、视杆细胞层，外界膜，外颗粒层等各层细胞层次分明，排列整齐，结构紧密；模型组小鼠视网膜各层细胞排列紊乱，色素上皮层细胞明显变薄；而通心络各剂量组小鼠视网膜各层细胞排列较清晰(见图1)。

2.4 各组小鼠给药后12周血液中炎性因子水平比较 给药后12周，各组小鼠血液中TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β水平比较，差异有统计学意义(P<0.01)；其中模型组及通心络各剂量组小鼠TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β水平高于对照组，通心络中、高剂组小鼠TNF-α、ICAM-1、IL-1β水平低于模型组，通心络各剂量组小鼠IL-6水平低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05，见表3)。

Table3 Comparison of blood levels of TNF-α，ICAM-1，IL-6 and IL-1β among various groups of mice 12 weeks after treatment

组别只数TNF-αICAM-1IL-6IL-1β对照组3363±067033±006210±040137±029模型组31893±355△750±110△643±060△1050±235△通心络低剂组31443±190△697±071△403±086∗☆883±171△通心络中剂组3960±130△☆420±080△☆390±061∗☆513±081△☆通心络高剂组3720±176∗★320±066△★380±040∗★393±070△☆F值2534460319972118P值000000000000

注：TNF-α=肿瘤坏死因子α，ICAM-1=细胞间黏附分子1，IL-6=白介素6，IL-1β=白介素1β；与对照组比较，*P<0.05，△P<0.01；与模型组比较，☆P<0.05，★P<0.01

2.5 各组小鼠给药12周后视网膜TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β mRNA及蛋白表达水平比较 给药后12周，各组小鼠视网膜TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β mRNA及蛋白表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.01)；其中模型组小鼠视网膜TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β mRNA及蛋白表达水平高于对照组，通心络各剂量组小鼠视网膜TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β mRNA及蛋白表达水平均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01，见表4、图2、图3)。

3 讨论

通心络胶囊是以人参、水蛭、全蝎、赤芍、蝉蜕等组方的中药复方制剂，具有益气活血、通络止痛功能。文献报道通心络具有改善血液流变学、血管内皮功能、微循环的功能，对临床DR患者有治疗作用[3]，但其具体机制尚不明确。DR发病机制复杂，包括持续性高血糖、氧化应激、炎性反应、细胞凋亡等[4]。本研究采用了自发性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠作为DR小鼠模型[5]，观察到通心络胶囊灌胃12周能明显改善KK/Upj-Ay小鼠视网膜形态学，视网膜各层细胞层次较清楚，小鼠血-视网膜屏障功能得到明显改善，表明通心络胶囊对治疗DR有一定的作用。但本研究观察到通心络胶囊并未明显降低小鼠体质量和FBG，故推测降糖不是通心络胶囊治疗DR的主要机制。

炎性反应在DR发生发展中占有重要地位[6]。朱丹等[3]认为DR是一种“炎性疾病”。主要的炎性因子有TNF-α、ICAM-1、IL-1、单核细胞黏附因子1(MCP-1)等[7]。DR中的炎性因子包括全身因子和局部因子。临床研究显示DR患者血清中全身炎性因子IL-1β、TNF-α、血管内皮生长因子(VEGF)浓聚，与 DR的发生和严重性密切相关[8]。本研究中，流式细胞术结果显示DR小鼠血清TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β水平较对照组小鼠升高，表明全身炎性因子可能共同作用于DR的发展。给予通心络胶囊灌胃治疗12周，小鼠血清TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β水平较模型组小鼠降低，提示通心络胶囊有抑制DR小鼠全身炎性因子的作用。

注：1为对照组，2为模型组，3为通心络低剂组，4为通心络中剂组，5为通心络高剂组

图1 各组小鼠视网膜形态学变化(HE染色，×200)

注：与对照组比较，*P<0.05，△P<0.01；与模型组比较，★P<0.01

注：TNF-α=肿瘤坏死因子α，ICAM-1=细胞间黏附分子1，IL-6=白介素6，IL-1β=白介素1β

图2 各组小鼠视网膜炎性因子mRNA表达水平的荧光定量PCR扩增曲线

Figure2 Amplification curve of real-time fluorescent quantitative PCR for retina inflammatory cytokines mRNA expression level of various groups of mice

注：1为对照组，2为模型组，3为通心络低剂组，4为通心络中剂组，5为通心络高剂组

图3 各组小鼠视网膜炎性因子表达水平的Western blotting结果

Figure3 Results of Western blotting of retina inflammatory cytokines expression level of various groups of mice

Suzuki等[9]研究发现DR玻璃体中炎性因子IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、MCP-1、血小板衍生因子(PDGF)、VEGF水平增高。玻璃体内IL-6、VEGF、ICAM-1与糖尿病黄斑水肿的严重程度呈正相关。在DR小鼠视网膜中，本研究也观察到了炎性因子TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β mRAN及蛋白表达水平升高，提示炎症在DR小鼠中的重要作用；同时观察到通心络胶囊能降低视网膜中TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β mRNA及蛋白表达水平，提示通心络胶囊不仅能降低全身炎性因子水平，还能抑制视网膜局部炎性因子的表达，最终达到抑制炎症治疗DR的作用。通心络胶囊十二味中药组方中，人参、水蛭和赤芍现代药理研究表明均具有显著的抗炎作用，因此本研究推测通心络胶囊抑制DR小鼠炎性因子表达与此有关，但其具体抗炎成分尚需进一步研究。另外，在本研究中，1～4 g生药/kg通心络胶囊量效关系有一定的趋势，但无差异。在通常研究中，化药有很明确的量效关系，但中药不同，很难有特别明确的剂量关系，也许是中药本身的特性。

目前，炎性递质已经成为了治疗视网膜损伤的治疗靶点，如VEGF阻滞剂[10]、血管紧张素2(Ang-2)抑制剂、TNF-α抑制剂等。通心络胶囊在临床应用多年，具有不良反应小的中药传统优势，对其进行深入研究将为临床治疗DR提供新的用药思路。

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3 朱丹，郗丹，李丹梅，等.通心络治疗2型糖尿病视网膜病变患者临床疗效观察[M]//吴以岭.络病学基础与临床研究.北京：中国科学技术出版社，2005：220-222.

4 Cheung N，Mitchell P，Wong TY.Diabetic retinopathy[J].Lancet，2010，376(9735)：124-136.

5 朱慧明，魏刚，张会欣，等.芪黄明目胶囊对糖尿病小鼠视网膜病变及生长因子表达的影响[J].中国全科医学，2012，15(10)：3551-3554.

6 Adamis AP.Is diabetic retinopathy an inflammatory disease?[J].Br J Ophthalmol，2002，86(4)：363-365.

7 Kowluru RA，Odenbach S.Role of interleukin-1beta in the pathogenesis of diabetic retinopathy[J].Br J Ophthalmol，2004，88(10)：1343-1347.

8 Koleva-Georgieva DN，Sivkova NP，Terzieva D.Serum inflammatory cytokines IL-1beta，IL-6，TNF-alpha and VEGF have influence on the developmentof diabetic retinopathy[J].Folia Med(Plovdiv)，2011，53(2)：44-50.

9 Suzuki Y，Nakazawa M，Suzuki K，et al.Expression profiles of cytokines and chemokines in vitreous fluid in diabetic retinopathy and centralretinal vein occlusion[J].Jpn J Ophthalmol，2011，55(3)：256-263.

10 Montero JA，Ruiz-Moreno JM，Correa ME.Intravitreal anti-VEGF drugs as adjuvant therapy in diabetic retinopathy surgery[J].Curr Diabetes Rev，2011，7(3)：176-184.

本文链接——

1 KK/Upj-Ay小鼠是一种毛色基因(Ay)突变的2型糖尿病动物模型，Ay基因不仅影响小鼠的毛色，还可引起代谢紊乱，也可出现高饮食、肥胖、高血糖、脂质代谢紊乱和高胰岛素血症，因此要比同周龄的C57BL/6正常小鼠体质量大很多。

2 自发性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠用于糖尿病视网膜病变研究已有多篇文献报道，如本文参考文献[5]。另外，光镜下也观察到了KK/Upj-Ay小鼠视网膜形态学变化(见图1)，故本研究以KK/Upj-Ay小鼠作为糖尿病视网膜病变模型。

3 本研究根据小鼠空腹血糖(FBG)分组，就是将所有的小鼠测定FBG，然后按照FBG水平从低到高排列，水平相近的4只小鼠配成1个区组。再根据随机数字表法，每个小鼠对应一个随机数字，在每个区组内将随机数字按大小排序，序号为1的为模型组，序号为2的为通心络低剂组，序号为3的为通心络中剂组，序号为4的为通心络高剂组，这样保证模型组及通心络低、中、高剂组小鼠平均FBG水平间有均衡性。