硝酸甘油的生物转化和耐药机制研究进展

荆程桥 综述 彭辉 审校

(1.新疆医科大学研究生学院，新疆乌鲁木齐 830011;2.新疆维吾尔自治区人民医院心血管内科，新疆 乌鲁木齐830011)

1 硝酸甘油的血流动力学效应

硝酸甘油(nitroglycerin，GTN)是治疗心绞痛、急性心肌梗死、慢性心力衰竭等心血管疾病的基础药物。GTN可以扩张外周静脉容量血管，减少回心血量从而降低心室前负荷和心室壁张力，扩张动脉减少后负荷和心室射血阻力，最终减少心室心肌做功和耗氧;同时GTN扩张大中冠状动脉及交通支增加心肌供血。这种增加心肌供氧和降低心肌耗氧作用对缺血状态的心肌有非常重要的保护意义[1]。

2 硝酸甘油和一氧化氮/环磷酸鸟苷信号通路

目前一致认为硝酸甘油在体内转化为一氧化氮(nitric oxide，NO)或类似的活性物质(S-亚硝基硫醇)，从而激活可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylate cyclase，sGC)，第二信使环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)产生增多，激活cGMP依赖性蛋白激酶(cGMP-dependent protein kinase，cGK)，降低细胞内钙离子水平，最终引起血管平滑肌细胞舒张。同时体外实验表明:与硝普钠(直接产生NO)不同，GTN并不能单独激活sGC，因此GTN是通过体内生物转化为NO或类似的活性物质发挥作用[2]。

3 硝酸甘油的生物转化

目前认为GTN在体内有着不同的代谢途径。生物活化途径:主要产生1，2-二硝酸甘油(1，2-glyceryl dinitrite，l，2-GDN)、亚硝酸盐、NO 或类似的活性物质;降解途径:代谢产物不能激活sGC，主要产生1，3-二硝酸甘油(1，3-glyceryl dinitrite，1，3-GDN)、硝酸盐和少量亚硝酸盐[2]。GTN的生物活化包括非酶途径和酶途径。

3.1 非酶途径

在体外实验中，N-乙酰半胱氨酸与GTN反应可以激活sGC;高浓度的L-半胱氨酸和高浓度的GTN反应亦能激活sGC。Kollau等[3]学者还发现抗坏血酸盐也可以与GTN反应产生NO(或者结构类似的化合物)从而激活sGC，但是这个化学反应的动力学参数是低的，而且cGMP的产生也是相对低的。因此这些非酶途径对于体内GTN的生物转化可能是有限的。

3.2 酶途径

目前研究已发现存在2种不同的酶途径。高剂量GTN生物转化，参与的酶有内质网细胞色素P450系统、谷胱甘肽巯基转移酶、黄嘌呤氧化酶;低剂量(临床治疗剂量)GTN生物转化，现在认为线粒体乙醛脱氢酶(mitochondrial aldehyde dehydrogenase，ALDH2)是关键酶[4]。下面详细介绍ALDH2对GTN的生物转化作用。

3.3 线粒体乙醛脱氢酶

在2002年，Chen、Stamler等在小鼠RAW264.7巨噬细胞中发现了一种蛋白可以催化GTN产生1，2-GDN和亚硝酸盐(1，3-GDN和硝酸盐很少)，并证实是线粒体乙醛脱氢酶;在兔体外(主动脉)和体内ALDH2特异性抑制剂实验中发现:GTN产生的1，2-GDN、cGMP均明显减少，GTN的扩血管和降压作用减弱甚至消失，硝普钠的扩血管和降压作用未受影响[5]。在随后的ALDH2基因敲除小鼠的实验中有着同样的发现，与野生型小鼠相比，在ALDH2基因敲除小鼠，主动脉GTN产生的1，2-GDN、cGMP很少，GTN的扩血管和降压作用几乎消失;同样的硝普钠对两种小鼠的扩血管和降压作用并没有差别，而且，高剂量的GTN对ALDH2基因敲除小鼠的扩血管和降压作用变化不大[6]。这些研究说明:ALDH2在(临床治疗剂量)GTN转化为NO过程中发挥重要作用，同时并不影响 NO和下游信号通路。

人类ALDH2基因第12外显子存在一个碱基突变(rs671)导致487位置的谷氨酸变为赖氨酸，突变纯合子型酶活性大约是正常的5%，突变杂合子型酶活性大约是正常的40%。这种基因突变在东亚人群中高达40%。临床研究发现:在携带ALDH2突变型基因(纯合子和杂合子)的人群组，GTN的扩血管、降压效应均显著下降，需要更大剂量的GTN来维持有效的作用，给予正常基因型的人群组ALDH2抑制药物戒酒硫(二硫化四乙基秋兰姆)后，GTN的扩血管、降压作用也减弱，但不影响硝普钠的扩血管、降压作用[7-8]。这些研究进一步说明，ALDH2在人体内(临床治疗剂量)GTN转化为NO过程中同样具有关键的作用。

Wenzl等学者通过晶体学技术和质谱分析技术提出了三种不同的ALDH2与GTN反应的分子机制。参与反应的活性基团包括ALDH2活性中心的3个相邻的半胱氨酸(Cys301、Cys302、Cys303)和空间上临近Cys302的1个谷氨酸(Glu268)。共同的第一步反应是Cys302与GTN的一个末端硝基(—NO2)反应产生中间产物ALDH2-硝基硫醇复合物(ALDH2-SNO2)并释放出1，2-GDN。(1)相邻的一个半胱氨酸Cys301(或Cys303)与ALDH2-SNO2反应释放出亚硝酸盐(通过线粒体氧化呼吸链和黄嘌呤氧化酶产生NO)同时和Cys302形成一个二硫键(可以被二硫苏糖醇还原)。(2)ALDH2-SNO2可逆性产生ALDH2-硫酰亚硝基复合物(ALDH2-SONO)，在Glu268和水分子共同作用下，ALDH2-SONO被水解产生次硝酸(HNO)，进一步可被超氧化物歧化酶(SOD)氧化为NO，同时在Cys302形成ALDH2-亚磺酸基团复合物(ALDH2-SOOH，不可以被二硫苏糖醇还原)。(3)ALDH2-SONO均裂产生NO和ALDH2-亚硫酰自由基复合物(ALDH2-SO－，可以被二硫苏糖醇还原)[9]。这些反应的分子机制尚缺乏详细的证据，需要进一步研究。

3.4 细胞液乙醛脱氢酶2和重组乙醛脱氢酶3A1

最近Berretta等[10]体外研究发现，在小鼠主动脉平滑肌细胞，GTN的生物转化主要是由细胞质中的ALDH2催化完成而非线粒体ALDH2。Lin等[11]学者研究进一步发现，在体外实验中，重组ALDH3A1(25%的氨基酸序列和ALDH2相同，活性中心含有243位置的半胱氨酸)也可以有效催化GTN产生NO。这些发现引起了关于GTN生物转化新的争论，对下一步研究有重要的意义。

4 硝酸甘油耐药机制

4.1 神经激素激活和血容量扩张学说

长期使用GTN可以反射性激活交感神经、肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin-system，RAS)和血管升压素的分泌。血浆内儿茶酚胺、血管紧张素Ⅱ、血管加压素水平上升增强了血管收缩，醛固酮和血管升压素引起体内水钠潴留，增加了血容量，从而对抗GTN的扩张血管和减少回心血量作用。但是神经激素激活和血容量增加的时间和耐药发生的时间并不完全一致，β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂、利尿剂并不总是改善GTN耐药，而且离体血管也可以出现耐药现象，因此这个学说并不能完全解释GTN耐药现象[4]。

4.2 氧化应激学说

在1995年Munzel等[12]学者提出一个新的 GTN耐药机制:GTN诱导的血管氧化应激可能是重要的耐药原因。他们发现，耐药兔主动脉的过氧化物水平显著高于对照组;Cu，Zn超氧化物歧化酶(可增加细胞内超氧化物歧化酶水平)可以显著改善GTN对离体耐药兔主动脉的扩张作用。Schulz等[13]学者亦发现在耐药人乳房内动脉(来自冠状动脉搭桥手术患者)，整个血管壁活性氧(reactive oxgen species，ROS)类物质同样大幅度增加。后来的研究发现许多抗氧化性药物可以部分甚至完全逆转GTN耐药，从侧面支持氧化应激学说。关于ROS的来源，早期认为可能是血管紧张素Ⅱ激活了细胞质中蛋白激酶C/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶系统。进一步研究发现，GTN可以诱导线粒体ROS的产生。Sydow等[14-16]学者研究发现，耐药大鼠的心肌、主动脉线粒体ROS均明显高于对照组，GTN可以诱导离体正常大鼠心肌线粒体ROS依赖浓度的增加。线粒体ROS的产生，可能与GTN在线粒体内的生物转化有关，但确切的机制有待进一步研究。在锰超氧化物歧化酶基因部分敲除小鼠(一种理想的线粒体氧化应激动物模型)实验中，低剂量 GTN(12.5 μg·min-1·kg-1，4 d)即可导致基因部分敲除小鼠耐药，而野生型小鼠未发生耐药。体外高剂量(200 μmol/L，30 min)GTN诱导两种小鼠主动脉，基因部分敲除小鼠主动脉出现更严重的耐药现象[17-18]]。研究还发现特异性线粒体抗氧化剂可以完全逆转GTN引起的小鼠内皮细胞氧化应激和主动脉耐药[19]，这些研究进一步证实了氧化应激学说。

最近研究发现:线粒体内的ROS可以渗入细胞质激活还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，进一步导致细胞液ROS的生成。因此GTN引起血管壁产生一个复杂的氧化应激循环网络[20]。

4.2.1 氧化应激对ALDH2的作用

许多研究发现耐药大鼠主动脉和心肌ROS增加的同时ALDH2活性降低，体外GTN诱导正常大鼠心肌线粒体，ALDH2 活性和 ROS 的产生呈负相关[14-15，21]。体外线粒体复合体Ⅲ抑制剂抗霉素A(可导致线粒体氧化应激)诱导正常大鼠心肌线粒体，ALDH2活性下降50%[22]。体外过氧亚硝酸盐诱导正常大鼠心肌线粒体，ALDH2活性依赖浓度的下降[19]。体外GTN诱导人大隐静脉(来自行冠状动脉搭桥术患者)，ALDH总活性显著下降，抗氧化剂二硫苏糖醇(DTT)可恢复ALDH的活性[23]。这些体内和体外研究表明:氧化应激导致了ALDH2的活性降低，减少了GTN生物转化。目前认为氧化活性物质可以氧化修饰ALDH2活性中心302位的半胱氨酸，形成一个二硫键，从而导致ALDH2功能障碍。

4.2.2 氧化应激对NO的作用

ROS可以和NO快速反应产生一种氧化性更强的活性物质——过氧亚硝酸盐。NO的直接减少影响NO/cGMP信号通路的激活。研究发现:耐药大鼠主动脉硝基化酪氨酸蛋白水平(过量过氧亚硝酸盐的标志物)上升，体外GTN诱导正常大鼠主动脉出现3-硝基化酪氨酸水平依赖浓度的增加[22]，肼屈嗪(强效的过氧亚硝酸盐清除剂)可以有效改善大鼠耐药[24]，这些研究均证实这个观点，而且说明过氧亚硝酸盐也是血管壁氧化应激重要成分。

4.2.3 氧化应激对sGC的作用

Weber等[25]研究发现过氧亚硝酸盐可能通过氧化修饰sGC中的的巯基(NO激活途径的必须基团)从而抑制NO对大鼠主动脉sGC激活，减少cGMP的产生，减弱GTN对主动脉的扩张作用。

4.2.4 氧化应激对血管内皮功能的影响

四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，BH4)是内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的重要辅因子，研究发现ROS和过氧亚硝酸盐可以将BH4氧化为二氢生物蝶呤(dihydrobiopterin，BH2)，引起eNOS解偶联，解偶联的eNOS不能催化NO的产生，反而催化产生更多ROS。研究还发现过氧亚硝酸盐通过硝基化作用导致前列环素合酶失活，降低血管前列环素水平[22]，因此内源性舒血管物质NO和前列环素合成抑制(内皮功能障碍)也是GTN耐药的重要机制。

4.3 其他的耐药机制

4.3.1 磷酸二酯酶1A1活性和表达增加

磷酸二酯酶 1A1(phosphodiesterase1A1，PDE1A1)是血管平滑肌细胞磷酸二酯酶的一种亚型，可以特异性水解cGMP。Kim等学者研究发现:在耐药大鼠主动脉，PDE1A1活性和表达显著增加，PDE1A1mRNA水平亦显著增加，同时长春西汀(选择性PDE1A1抑制剂)可以有效改善耐药大鼠主动脉对GTN的舒张反应和cGMP的增加。该研究表明:持续使用GTN可以增加血管平滑肌细胞PDE1A1活性和表达，cGMP水解加剧，导致GTN的血管扩张作用减弱[26]。但是PDE1A1活性和表达增加的机制仍不清楚，需要进一步的研究。

4.3.2 sGC对NO敏感性下降

最近Sayed等学者研究发现，在给予巯基亚硝基化半胱氨酸的大鼠和耐药的大鼠均发现，巯基亚硝基化sGC水平显著上升和sGC对NO供体药物亚硝基铁氢化钠的敏感性丧失(cGMP生成明显减少)即亚硝基铁氢化钠耐药;体外GTN诱导正常大鼠主动脉平滑肌细胞，巯基亚硝基化sGC依赖浓度的增加和sGC对亚硝基铁氢化钠的敏感性依赖浓度的下降[27]。过往的许多研究均证明GTN可以导致巯基亚硝基化半胱氨酸产生，这些研究表明持续使用GTN引起sGC的巯基亚硝基化，导致sGC对NO的敏感性下降，第二信使cGMP产生减少，GTN的扩张血管作用随之减弱。

4.3.3 eNOS解偶联

研究发现eNOS蛋白结构中1 177位丝氨酸(Ser 1177)、495位苏氨酸(Thr495)磷酸化水平和半胱氨酸巯基谷胱甘肽化水平与 eNOS的活性密切相关[16]。最近Knorr等[16]学者研究发现在耐药大鼠主动脉，eNOS发生解耦联的同时，Ser 1177磷酸化降低，Thr495磷酸化升高，半胱氨酸巯基谷胱甘肽化升高(同样出现在体外GTN诱导的人内皮细胞)，以及GTP环化水解酶1(重要的BH4合成酶)表达下降，而且替米沙坦(血管紧张素Ⅰ受体拮抗剂)可以逆转这些异常改变，最终改善耐药。这些研究表明，长期使用GTN可以改变eNOS化学结构和降低GTP环化水解酶1表达(可能是激活RAS引起的化学修饰作用)，导致eNOS解耦联，产生耐药，这种化学修饰发生的具体机制尚不清楚，需进一步研究。

5 结语

近年来关于GTN的生物转化和耐药机制的研究取得了许多新的进展。但仍然存在许多疑问和争论，有待进一步的研究探索。同时基础研究发现许多药物可以预防和改善GTN耐药，初步的临床试验也证实了N-乙酰半胱氨酸、左旋蛋氨酸、肼屈嗪、卡托普利、卡维地洛、阿托伐他汀具有改善耐药的作用[4，28-29]，这些研究对临床上 GTN 耐药的防治具有重要的意义，需要进一步的研究寻找针对临床GTN耐药的最佳药物。

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