鸡肠毒综合症病因研究报告(三)—病毒的分离鉴定

何雷堂 （河南省鹤壁市畜牧局 458030） 何丽丽 （河南省鹤壁市淇滨区动物疾病预防控制中心）

朱拥军 （河南省浚县新镇镇畜牧兽医站） 张艳瑞 李淑沛 （河南省鹤壁市雨田兽药经营部）

鸡肠毒综合症自发现以来,在兽医临床上一直不间断的发生,以前呈现散发、点发现象，近年来呈现大面积流行。并呈现以下共性特征：（1）有典型症状：料粪、肉便、采食量降低；（2）治疗特点明显：治疗有效、不去病根、反复发病；（3）发生率高：几乎90%以上的鸡场都不同程度的发生该病；（4）病因解释多种多样：计19种之多，囊括了细菌、病毒、寄生虫、营养、环境、毒素等能引起致病的各个方面，其中权威解释是“魏氏梭菌和小肠球虫混合感染”；（5）隐性损失大：表现在饲料转化率低，生长缓慢，后期往往与大肠杆菌、新城疫混合感染，造成死亡上升。该病对养鸡业的健康发展已构成了重大威胁。笔者从2007年开始，对发生肠毒综合症的鸡群从细菌、病毒、寄生虫等方面进行了研究，最后弄清了肠毒综合症的病因。

1 材料和方法

1.1 病毒分离 无菌采取病死肉鸡的气管、肝脏，并且取蛋鸡取输卵管和气管进行病毒分离。将每个鸡场所取的病料按体积比(1:1)的比例加入灭菌生理盐水，再按每毫升糜状物各1万单位加入“双抗”，调pH值为4.5～5.8，然后用高速组织捣碎机粉碎成糜状，离心，用上清液接种孵化至10.5日龄的SPF鸡胚(或无抗鸡胚)，每胚接种0.3ml。置37℃孵化，12h后，每隔4h照蛋1次，将死亡鸡胚挑出，置于4℃冷藏。并作好各项记录。凡是一代分离物为阴性的，再盲传一代，仍为阴性的弃之。对于一代分离物有细菌污染时，用G6砂芯漏斗过滤除菌，滤过液接种鸡胚，每胚0.3ml，再次进行培养。

1.2 病毒的鉴定试验 （1）检测分离株的血凝价(微量血凝试验)。（2）检测分离株的血凝抑制价。0.03ml分离株的尿囊液分别与新城疫、H5禽流感、H9禽流感、H7禽流感、减蛋综合症等抗血清等量混合，让抗体和抗原发生中和反应，然后检测中和后的血凝价，检测结果加上1则为该分离毒的血凝抑制价。如果分离毒尿囊液与某种病毒的抗血清反应后，血凝价明显降低，则可确认该分离毒就是与此种抗血清相对应的病毒。禽流感病毒株N亚型的确定，委托农业部动检所鉴定。

1.3 病毒的毒力试验 测定了编号为“AI1”禽流感分离毒的静脉致病指数。方法：取42日龄的SPF鸡12只，其中10只翅膀静脉注射一代尿囊液10倍稀释液0.1ml/只，2只注射等量生理盐水作对照，观察10d。每次观察时，正常鸡得0分，患病鸡得1分，瘫痪鸡得2分，死亡鸡得3分。IVPI值是观察10d时间内每只鸡的平均得分。

1.4 病毒含量的测定 检测了编号为“AI1”禽流感分离毒的鸡胚半数感染量(EID50)。方法：取40枚(购于河南农林佳多有限公司)无免鸡蛋，分为4组，每组10枚，然后将病毒原液用生理盐水进行10倍递进稀释，选择1010、1011、1012、10134个稀释倍数，每个稀释倍数各接种10枚10.5日龄的无抗鸡胚，每胚0.1ml，然后置于37℃孵化，24h照蛋，死亡胚取出并弃之，24h后，每4h照蛋一次，取出死胚并及时置于4℃冷贮，孵至96h时，所有活胚全部取出，置于4℃冷藏过夜，对所有胚进行检测血凝性，HA效价大于4的为阳性。

1.5 攻毒发病试验 攻毒用编号为“AI1”禽流感分离毒的第5代毒。购买18只15日龄无抗笨鸡(购于河南农林佳多有限公司)，分为3组，每组6只，攻毒途径是滴鼻。其中第1组每只鸡滴鼻1滴约0.05ml尿囊液原液，第2组每只鸡滴鼻2滴约0.10ml尿囊液原液，第3组每只鸡滴鼻生理盐水作为空白对照。攻毒后，连续观察15d。

1.6 治疗试验 详细观察和记录了发生肠毒综合症的2个鸡群的治疗过程。试验中所用H9N2禽流感自家灭活油乳剂疫苗。由鹤壁市雨田畜牧兽医技术研究选取编号为“AI1”的H9禽流感分离毒作为种毒，按照生产规程加工生产的。（1）浚县卫贤乡北纸坊村张某鸡场的治疗试验。3000只25日龄蛋雏鸡，发病时间是2010年9月17日。鸡群有肉便、料粪等症状，每天死亡5～7只，诊断为肠毒综合症，治疗方法：一是全群免疫注射一次H9N2禽流感自家苗，二是鸡群用清瘟败毒散、磷霉素散拌料，连用7d。（2）鹤壁市淇滨区大来店镇七里铺村石某养鸡场的治疗试验。3500只35日龄蛋雏鸡，发病时间是2010年3月5日。鸡群有肉便、轻微呼吸道症状，诊断为禽流感引起的肠毒综合症，该病例没有并发症和继发症，采取H9N2禽流感自家苗免疫1次，同时抗生素拌料3d预防细菌感染等措施。

1.7 发病鸡群H9禽流感抗体检测 对发生肠毒综合症的2个鸡群，用微量血凝抑制试验检测鸡群HI抗体。

1.8 新城疫分离毒的静脉致病指数(IVPI)试验 检测了编号为ND1的新城疫分离毒的IVPI。具体方法：取42日龄的无抗鸡10只，翅膀静脉注射一代尿囊液10倍稀释液0.1ml/只，观察10d。每次观察时，正常鸡得0分，患病鸡得1分，瘫痪鸡得2分，死亡鸡得3分。IVPI值是观察10d时间内每只鸡每天的平均得分。

2 结果

2.1 病毒分离总体情况 18个发病鸡场共分离到13株病毒，其中8株为低致病力禽流感(H9N2)，另外5株为新城疫病毒。

表1 病毒分离基本情况

2.2 8株禽流感病毒的鉴定

表2 8株禽流感病毒的鉴定结果

从血细胞凝集图像具有较好的稳定性、病毒生长良好等方面进行筛选，确定用AI1号病毒株，进行H亚型和N亚型的检测，并进行静脉致病指数试验、鸡胚半数感染量(EID50)的测试、攻毒试验、治疗试验。

2.3 分离株的H亚型、N亚型 H亚型用农业部动检所惠赠的H9阳性血清进行检测，同时委托农业部动检所进行H亚型的复检和N亚型的检测。AI1号分离毒为A型禽流感中的H9N2亚型病毒。

2.4 分离株的静脉致病指数(IVPI) 10只鸡在每天内的得分情况。D1～D10分别表示第1～10d。

表3 禽流感分离株的致病指数

则IVPI值是19/100=0.19，可见分离毒是弱毒。此毒力与生产上所见不一致。生产上有鸡只死亡现象，而该试验中没有死亡。

2.5 分离株的鸡胚半数感染量(EID50)

表4 分离毒株的鸡胚半数感染量

EID50=10-12.26，0.1ml。可见，病毒含量相当高。

2.6 攻毒结果 第1组、第2组在攻毒后第3天分别有5只、6只鸡开始出现呼吸道症状，第1组中1只鸡有肉便，第4天时，症状加重，并开始有绿便，第5天绿便颜色更深，并有白色尿酸盐，第8天时呼吸道症状变轻，粪便颜色也渐渐变轻。2组症状几乎一样重。试验至第12天时，鸡群几乎正常，但第1组和第2组中仍有个别鸡有轻微的呼吸道症状，表现为有甩鼻、嗓子内有“吭吭”的声音。攻毒试验结论：（1）本毒属于弱毒，试验室条件下不论免疫鸡和非免疫鸡，不会造成鸡只死亡；（2）发病试验并没有出现和临床一样的症状。经查资料得知，大肠杆菌分泌的酶会加快HA蛋白的裂解，从而增加禽流感病毒的毒性。试验室条件下，试验鸡只没有感染细菌性疾病，所以试验鸡只的症状较轻，并且没有出现死鸡的情形。

2.7 治疗效果 浚县卫贤乡北纸坊村鸡场，治疗3d后，死亡数降至1只/d，或2d死1只。稀泻、肉便、料粪等症状减轻。但一直有呼吸道的声音。9d后，鸡群痊愈，没有反复发生。鹤壁市淇滨区大来店镇七里铺村养鸡场。9d后，料粪、肉便彻底消失，鸡群病愈，没有反复发生。

2.8 发病鸡群的H9禽流感抗体结果 列出2个发病鸡群的抗体监测数据：（1）90日龄的蛋型青年鸡。H9禽流感疫苗免疫过2次，20日龄1次，50日龄1次。从30日龄开始一直有肉便、料粪等症状，用中药和西药治疗过3次，体形偏瘦。90日龄时H9抗体是：12、11、11、11、11、11、12、12。（2）120日龄的蛋鸡群，有肉便、料粪的症状。H9疫苗分别在25日龄、60日龄各免疫过一次。120日龄时的H9抗体是：12、12、12、12、12、12、12、12。这两个发病鸡群，肠毒综合症反复多次发生，每次使用中药和西药联合治疗均有明显效果，但“不去病根”，停药后7～10d，又会发病。这2个鸡群在每次治疗时，均未考虑到使用H9禽流感疫苗。根据抗体上升、衰减规律，这2个鸡群，在抗体检测时H9抗体应该在10以下，而实际结果是12，远远高于疫苗应该产生的抗体水平，据此可推断这2个鸡群曾经或正在感染禽流感H9野毒。

2.9 新城疫分离毒的毒力(静脉致病指数(IVPI)

表5 新城疫毒病的致病指数

表中D1～D10表示第1～10天，计算IVPI。IVPI值是219/100=2.19，可见分离毒是强毒。剖检死鸡可见到腺胃乳头出血、喉头出血等新城疫病的典型病变。

3 讨论

（1）通过H9N2禽流感的攻毒试验、治疗试验，发病鸡群的H9抗体水平，可以确定低致病性禽流感(H9N2)感染，是鸡肠毒综合症发生的主要原因。综合分析笔者以前开展的细菌分离、病毒分离、小肠球虫检测以及攻毒和治疗试验，得出结论“低致病性禽流感(H9N2)感染，和/或继发/并发以大肠杆菌为代表的细菌性疾病是导致鸡肠毒综合症发生的原因，小肠球虫对肠毒综合症的贡献率极低。（2）H9禽流感病毒通过呼吸道传播，具有传染快、传播远等特点，本论文的研究结论，为肠毒综合症具有广泛的发生率找到了理论依据。（3）H9禽流感病毒，属于RNA病毒，极易产生变异。因此，许多鸡群虽然免疫过H9疫苗，但由于野毒基因结构的漂移，仍可出现H9病毒感染，出现隐性带毒和排毒的情况。这就是H9禽流感不论免疫场或非免场都具有高发生率的原因。（4）低致病性禽流感(H9N2)感染导致鸡肠毒综合症发生的发病机理探讨。①分离的低致病性禽流感(H9N2)毒株是一个弱毒株，其感染家禽后不会造成直接死亡，由于病毒的感染—排毒—再感染循环长期存在，鸡群长期处于健康隐性带毒状态。②低致病性禽流感病毒可引起严重的免疫抑制。用低致病的H9禽流感病毒进行的人工发病试验结果表明，低致病性禽流感病毒可引起严重的免疫抑制。肉鸡人工接种H9N2禽流感病毒，发病后接种新城疫疫苗，12d后进行抗体水平检测，结果实验组与对照组相比，血凝抑制抗体价比对照组低2～3个滴度。采取发病后的脾脏、胸腺、法氏囊、骨髓进行组织学检查，结果，脾脏、胸腺、法氏囊、骨髓等组织均产生严重病变，可见低致病性禽流感病毒可破坏免疫系统，导致严重的免疫抑制。③鸡群出现免疫抑制后，往往继发大肠杆菌或其它病原的感染，造成家禽发病。④小肠球虫的传播方式是通过鸡只接触粪便或粪便污染饲料和饮水后，球虫卵囊通过消化道进入体内，不会通过空气传播。这种传播方式决定了球虫病只会呈现点发，而不会出现在一个地区、甚至一个县、一个省内大面积发生的情形。而肠毒综合症的发生率很高，各地均有大面积的发生。所以，仅从球虫传播方式来看，小肠球虫就不可能是肠毒综合症发生的原因。研究过程中只有一个鸡群分离到了小肠球虫卵囊，而另外的17个场没有检测到，也说明了小肠球虫不是肠毒综合症的病因。至于检测到的这一个场，可有是鸡群感染低致病性禽流感(H9N2)后，免疫力下降，而环境中又有球虫卵囊，从而继发的原因。第五、大肠杆菌是条件性致病菌，其在环境中大量存在，而沙门氏菌、巴氏杆菌、魏氏梭菌在环境中存在较少，这就是18个场分离到的继发细菌中，大肠杆菌多达16个场，而其它菌较少的原因。由本试验看到，低致病性禽流感(H9N2)感染造成免疫抑制后，鸡群生存环境中有哪种细菌就会继发感染哪种细菌。（5）临床制订并推广了肠毒综合症的如下治疗措施：发病鸡群免疫H9禽流感疫苗、新城疫-禽流感二联油苗或H9禽流感自家苗，以控制低致病性禽流感(H9N2)感染，同时使用继发/并发病的防治药物。经过多年的推广应用，效果良好，表现在凡经治疗的病例一般一次即可治愈，不会反复发生。（6）在肠毒综合症防控过程中发现，使用与本地野毒株基因结构相近的H9种毒生产的禽流感疫苗防控效果较好，反之，较差。因此，在防控肠毒综合症时，选择本地毒生产的自家苗或与本地毒基因结构相近的商品疫苗效果较好。

[1]王新华.禽病检验[m].成都: 四川科学技术出版社.1996.

[2]美国禽病学家协会编辑委员会.禽病原分离鉴定实验室手册[m](第3版).北京: 农业大学出版社.1993.

[3]甘孟侯.禽流感[m](第2版).北京: 中国农业出版社.2002: 122-156.

[4][美]Y.m.Saif.禽病学[m](第11版).北京: 中国农业出版社.2005.

[5]董志刚.关于肠毒综合症问题[J].中国动物保健, 2010(1): 42-44.

[6]郭二兵.肉鸡肠毒综合症的防治[J].汕头科技, 2011(4): 29-31.

[7]刘彪.鸡肠毒综合症的病因分析与防治[J].中国家禽, 2007, 24: 34.

[8]庞海龙.鸡肠毒综合症的防治.畜牧兽医杂志[J], 2012(6): 123-124.

[9]杨树华.鸡肠毒综合症的综合防制[J].现代畜牧兽医, 2008(2): 32-33.

[10]李春花.一例肉鸡肠毒综合症的诊治与分析[J].吉林畜牧兽医, 2010(2): 31-32

[11]陈东.鸡肠毒综合征的再认识[J].养禽与禽病防治, 2011(5): 39-41.

[12]王凯.一起蛋鸡球虫病并发肠毒综合症的诊治报告[J].家禽科学, 2015(5): 39-40.