黄芪注射液对糖尿病非酒精性脂肪肝模型大鼠血糖、血脂及肝脏脂肪分化相关蛋白表达水平的影响

梁 栋，梁 钢，刘云峰，杨 静

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种以肝细胞脂肪变性为主，与酒精性肝病类似而无过量饮酒史的临床病理综合征。2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者由于肥胖、高脂血症等因素，因而更易发生NAFLD［1］。黄芪为中药益气药，有补益脾肺，益气补阳之功效，已广泛用于临床。据报道，黄芪可使高脂血症小鼠血清三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）水平降低，还具有抗脂质过氧化、抗氧自由基等作用［2，3］。本研究旨在观察黄芪注射液对糖尿病合并NAFLD大鼠血糖、血脂、肝脏形态学变化及脂肪分化相关蛋白的影响。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备 雄性清洁级Wistar大鼠48只，体质量180 g～200 g，购自山西医科大学实验动物中心，实验经伦理委员会审查通过。将Wistar大鼠随机选择16只作为正常对照组，喂以普通饲料，其余30只用于制备糖尿病非酒精性脂肪肝模型，饲养环境控制在22℃～25℃。造模方法：高糖高脂饲料饲养（普通饲料66.5%、蔗糖20%、猪油10%、胆固醇2.5%、胆酸盐1%）。饲养4周后以50 mg／kg的剂量一次性腹腔注射链脲佐菌素，继续高糖高脂饲料喂养4周。空腹尾静脉采血测空腹血糖（FBG），以3次FBG＞11.1 mmol／L作为成模标准。将32只造模成功大鼠随机选择16只作为干预组，余16只作为模型组。干预组大鼠每日给予黄芪注射液3 mL／kg腹腔注射，对照组及模型组给予同体积生理盐水。

1.2 标本采集及检测 于干预后4周、8周（实验12周、16周）分批颈椎脱臼处死大鼠，心脏采血6 m L～8 m L，放于消毒干燥的EP管中，待血液凝固后1 000 r／min离心15 min，分离血清，-20℃保存待检。取大鼠肝脏右叶中部标本，一份置于-80℃冰箱保存，一份置于10%甲醛溶液中固定。血糖测定采用葡萄糖氧化酶法。血TG、TC采用全自动生化分析仪检测，试剂盒购自北京中杉试剂公司。

1.3 肝脏HE染色标本制备 梯度浓度的乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，制成厚度为3μm切片，行苏木素-伊红染色，中性树胶封片。

1.4 免疫印迹检测肝脏ADRP的表达水平 称取肝脏组织各0.1 g，按1∶1比例加入组织裂解液，4℃离心机，10 000 r／min，离心10 min，取上清，紫外分光光度计上测OD值，计算蛋白含量。配制8%和5%SDS-聚丙烯酰胺分离胶和浓缩胶，电泳槽中加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液，60 V预电泳40 min，100 V电泳1 h。湿转膜法将蛋白转至NC膜上，设定参数100 V、350 m A转膜3 0 min。蛋白干粉封闭，按照1∶1 0 0 0浓度稀释ADRP一抗（santa cruz，sc-32888），将膜置于其中，4℃冰箱过夜，TBST缓冲液洗膜3次后置于二抗中室温轻摇反应1 h，TBST洗膜3次，ECL发光液显色，凝胶成像仪曝光显色。Bandscan图像分析软件对显影条带进行灰度分析，以平均灰度值作为蛋白的相对表达水平。

1.5 统计学处理 采用SPSS15.0软件进行统计学处理。计量数资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，检验水准a=0.05。

2 结 果

2.1 各组大鼠血糖及血脂的变化 8周时，模型组及干预组大鼠血糖、血TG及TC水平显著高于对照组（P＜0.05）；12周时，干预组大鼠血糖、血TG及TC水平略低于模型组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；16周时，干预组大鼠血糖及TG水平明显低于模型组（P＜0.05）。详见表1。

表1 各组大鼠血糖、血TG及TC水平比较±s） mmol／L

表1 各组大鼠血糖、血TG及TC水平比较±s） mmol／L

组别 血糖TG TC对照组 实验前5.33±0.17 0.79±0.20 1.53±0.26 8周 5.39±0.45 0.82±0.16 1.47±0.15 12周 5.26±0.31 0.80±0.27 1.60±0.22 16周 5.42±0.48 0.86±0.19 1.81±0.34模型组 实验前 5.29±0.62 0.84±0.27 1.49±0.31 8周 12.97±3.241） 1.35±0.461） 2.35±0.601）12周 16.08±2.421） 1.96±0.531） 3.26±0.721）16周 21.15±4.971） 2.86±0.491） 4.03±0.551）干预组 实验前 5.38±0.55 0.81±0.31 1.45±0.27 8周 14.02±4.511） 1.42±0.381） 2.57±0.521）12周 15.82±3.041） 1.79±0.471） 3.04±0.391）16周 17.47±3.171）2） 1.95±0.541）2） 3.18±0.641）与对照组同一时间相比，1）P＜0.05；与模型组同一时间相比，2）P＜0.05

2.2 各组大鼠肝脏形态学变化 正常对照组大鼠肝小叶结构正常，肝细胞大小均匀一致，肝索及肝窦排列整齐。实验12周、16周时，模型组大鼠肝脏发生不同程度的脂肪变性，光镜下表现为肝细胞质中出现大小不等的空泡（脂滴），细胞核偏向细胞的一侧，中央静脉，汇管区及肝窦可见大量炎细胞浸润。干预组大鼠12周时肝脏脂肪变性程度与模型组大鼠基本相当，而炎细胞浸润程度较模型组程度轻。至实验16周时，干预组大鼠肝脂肪变性程度明显减轻，炎细胞浸润基本消失。

2.3 不同组别大鼠肝脏ADRP的表达水平 与对照组相比，模型组大鼠肝脏ADRP的表达水平显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05），12周、16周时，干预组大鼠肝脏ADRP的表达水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见图1。

图1 ADRP在大鼠肝脏中的表达

3 讨 论

糖尿病是目前威胁人类健康的主要慢性病之一。糖尿病患者由于长期的高血糖，会出现多种并发症，其中非酒精性脂肪肝较为常见。就机制而言，由于胰岛素抵抗促进外周脂肪分解和高胰岛素血症使肝细胞发生脂肪变性，另一方面，氧化应激引起肝细胞发生炎症反应，甚至发生坏死和纤维化［4］，目前临床治疗NAFLD主要以改善胰岛素抵抗，降低肝脏非酯化脂肪酸水平，改善氧化应激及内质网应激，纠正促纤维化、促炎因子与抗纤维化、抗炎因子之间的失衡为主。二甲双胍、他汀类及贝特类药物虽然可以从不同角度改善肝脏的病变程度［5-7］，但副反应也较为明显，例如：二甲双胍具有一定的心脏毒性和骨折风险。黄芪是我国传统中药较常用的一种，且黄芪具有毒副反应小的特点，有研究报道黄芪对预防糖尿病并发症的发生和进展具有重要作用。

本研究首先采用高糖高脂饲料和链脲佐菌素建立糖尿病非酒精性脂肪肝大鼠模型，通过对模型组大鼠血糖、TG和TC的检测发现，模型存在明显的脂代谢紊乱，肝脏病理切片证实脂肪变性发生，表明糖尿病NAFLD模型构建成功。经过4周黄芪注射液的治疗，至实验12周时，干预组大鼠血清血糖、TG和TC水平均低于模型组，但差异无统计学意义。肝脏病理学切片检查显示，干预组大鼠12周时肝脏脂肪变性程度与模型组大鼠基本相当，而炎细胞浸润程度较模型组程度轻。至16周时，干预组大鼠血清血糖及TG水平明显低于模型组，差异有统计学意义，且干预组大鼠肝脂肪变性程度明显减轻，炎细胞浸润基本消失，提示黄芪注射液早期通过减轻炎症反应对NAFLD大鼠肝脏起到一定的保护作用，并且随着治疗的进行，可延缓肝脏的脂肪变性进程。

脂肪分化相关蛋白是一种脂滴表面蛋白，在几乎所有类型的哺乳类培养细胞中均有表达；在机体内ADRP表达于脂肪组织、肝脏、肌肉、乳腺、胰腺、小肠黏膜等，在高脂饮食诱导的脂肪肝、非酒精性脂肪肝以及酒精性脂肪肝内ADRP蛋白亦显著增加［8，9］，研究表明能够诱导肝内TG增加的刺激均可增加肝细胞内ADRP蛋白的表达，且ADRP含量与肝细胞内脂质含量呈正相关，所以ADRP被认为是肝脏脂质蓄积的标记物［10］。本研究通过Western-blot检测了大鼠肝脏ADRP蛋白的表达水平，结果显示，与对照组相比，NAFLD大鼠肝脏ADRP水平显著增高，经黄芪注射液治疗后，NAFLD模型肝脏ADRP的表达水平下调，说明黄芪注射液可减少肝细胞脂质蓄积，减轻脂肪变性程度。

综上所述，黄芪注射液可改善NAFLD大鼠血糖血脂代谢紊乱，减轻肝脏的炎症反应和变性，具有一定的肝脏保护作用。而其发挥作用的具体机制以及对人NAFLD的疗效尚待进一步研究。

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