丹参酮ⅡA磺酸钠对2型糖尿病大鼠心肌TNF-α mRNA表达的影响*

2014-05-05 10:36杨海玉杨爱成廖晓春
中国中医急症 2014年3期
关键词:磺酸钠丹参酮心肌细胞

杨海玉 于 涛 杨爱成 廖晓春

(广东省江门市五邑中医院,广东 江门 529030)

丹参酮ⅡA磺酸钠对2型糖尿病大鼠心肌TNF-α mRNA表达的影响*

杨海玉 于 涛△杨爱成 廖晓春

(广东省江门市五邑中医院,广东 江门 529030)

目的评价丹参酮ⅡA磺酸钠对2型糖尿病大鼠心肌肿瘤坏死因子(TNF)-α mRNA表达的影响,探讨其对糖尿病心肌病的保护机制。方法 将大鼠随机分为正常组、模型对照组及丹参酮ⅡA磺酸钠组。成模后丹参酮ⅡA磺酸钠组给药12周,留取血及心肌标本用放免法检测各组大鼠血浆TNF-α,RT-PCR方法检测心肌组织中NF-κB、TNF-α mRNA表达水平。结果模型对照组大鼠血浆中TNF-α水平较正常对照组明显升高(P<0.01),且心肌组织中NF-κB、TNF-α mRNA表达较正常对照组明显增加(P<0.01)。给药12周后,丹参酮ⅡA磺酸钠组心肌组织中NF-κB、TNF-α mRNA表达较模型对照组明显降低,两组之间差异显著(P<0.05)。结论丹参酮ⅡA磺酸钠可能通过抑制2型糖尿病大鼠心肌组织中NF-κB通路,减少TNF-α mRNA表达,对2型糖尿病大鼠心肌提供保护作用。

糖尿病心肌病 丹参酮ⅡA磺酸钠 肿瘤坏死因子-α 核因子-κB

糖尿病心肌病是一种独立的糖尿病心血管并发症,它是糖尿病引起心脏微血管病变和心肌代谢紊乱所致的心肌广泛局灶性坏死,早期通常表现为舒张功能不全,晚期以收缩功能不全为主,易发生充血性心力衰竭[1],但其发病机制十分复杂,至今仍未完全阐明。糖尿病时高血糖可通过多种途径激活机体炎症反应,是导致糖尿病继发性病变的重要原因。本实验通过建立2型糖尿病大鼠模型,观察循环中肿瘤坏死因子(TNF)-α和心肌中NF-κB、TNF-α mRNA的表达水平,研究丹参酮ⅡA磺酸钠的干预作用,进一步探讨2型糖尿病心肌病的保护机制。

1 材料与方法

1.1 动物 成年健康Wistar雄性大鼠30只,体质量180~220g,由南方医科大学动物研究中心提供。

1.2 药物与试剂 丹参酮ⅡA磺酸钠由上海第一生化药业提供,实验时以蒸馏水配制成所需浓度;链脲佐菌素(STZ),由广州捷倍斯生物科技有限公司提供。

1.3 分组与造模 30只健康雄性Wistar大鼠适应性饲养1周,按抽签法随机选取10只大鼠为正常对照组,给予普通饲料。其余20只大鼠为进行造模,给予高糖高脂饲料(蔗糖∶猪油∶奶粉∶鸡蛋∶普通饲料=30∶20∶4∶2∶63,质量比)喂养。1月后以小剂量STZ 25 mg/kg,溶于0.1 mol/L枸橼酸缓冲液(pH4.4)一次性腹腔注射诱导大鼠模型。正常组仅腹腔注射等量枸橼酸缓冲液,后每日以同体积蒸馏水灌胃1次。模型组在腹腔注射STZ 2周后断尾测空腹血糖,连续2次>7.8 mmol/L者为糖尿病大鼠。

1.4 给药方法 造模成功的糖尿病大鼠再编号按抽签法随机分为模型对照组、丹参酮ⅡA磺酸钠组,各10只。于成模后第2日,丹参酮ⅡA磺酸钠组大鼠每天按10 mg/kg体质量腹腔注射丹参酮ⅡA磺酸钠,其余2组给予等体积蒸馏水腹腔注射,实验周期为12周。

1.5 标本采集与检测 第12周结束时,禁食12~14 h,测定血糖(罗氏罗康全活力型血糖仪)后,10%乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠。腹主静脉取血测血脂、血浆Ins水平及TNF-α;迅速取出心脏,冰盐水冲洗后称左心室质量,取部分左心室组织置于10%中性甲醛固定,供苏木精-伊红(HE)染色;另取部分心肌置于液氮中留做心肌NF-кB、TNF-α mRNA的检测。(1)血浆TNF-α的测定:采用放射免疫法,药盒由上海英骏生物技术有限公司提供。(2)心肌中NF-кB、TNF-α mRNA表达检测:采用RT-PCR方法检测mRNA的表达水平。引物序列依据文献报道设计,由上海英骏生物技术有限公司提供。β-肌动蛋白(β-actin):上游引物5′-ATTG TCAGCAATGCATCCTG-3′,下游引物5′-ATGGACTGTgGTCATGAGCC-3′;TNF-α:上游引物5′-TGCCTCAG CCTCTTCTCATT-3′;下游引物5′-CCCATTTGGGAAC TTCTCCT-3′;NF-кB:上游引物 5′-CGCCTCAGAATCGgCTCTTG-3′;下游引物5′-TCCACTCGGAT ACTAGTCgC-3′。反应体系(25 μL):SYBR Premix Ex TAQTM(2×)12.5 μL,D H2O 8.5 μL,cDNA 2 μL,PCR Forward Prime (10 μmol/L)1 μL,PCR Rervise Prime(10 μmol/L)1 μL。TNF-α基因扩增条件为:95℃,3 min(1个循环);95℃,20 s,60℃,40 s(40个循环);NF-кB基因扩增条件为:95℃3 min,然后95℃40 s,60℃40 s(35个循环)。以β-actin作为内参,取PCR产物凝胶成像后用图像分析系统分析结果。

1.6 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以±s)表示,采用t检验、χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组空腹血糖(FPG)、血脂、血浆胰岛素(Ins)和TNF-α水平比较 见表1。模型对照组大鼠FPG、血浆Ins、TG和TNF-α水平均明显高于正常对照组(P<0.01);与模型对照组比较,丹参酮ⅡA磺酸钠组各指标均有下降,其中TNF-α下降明显,差异具有统计学意义(P<0.01)。

表1 各组FPG、血浆Ins、血脂及TNF-α水平比较(±s)

表1 各组FPG、血浆Ins、血脂及TNF-α水平比较(±s)

与正常对照组比较,#P<0.01;与模型对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。下同。

组 别 n FPG(mmol/L)Ins(mU/L)TG(mmol/L)TNF-α(μg/L)正常对照组 10模型对照组 10 5.81±1.27 13.4±2.6 0.58±0.11 3.21±0.77 22.15±4.30# 23.2±5.6# 4.17±0.93# 6.44±1.81#丹参酮ⅡA磺酸钠组 10 19.98±3.37 21.5±4.3 3.85±0.81 4.34±1.26**

2.2 各组大鼠心肌组织病理变化 见图1。正常组大鼠心肌细胞排列整齐、致密,结构清晰,细胞核呈卵圆形;模型对照组大鼠心肌疏松,淡染,提示大鼠心肌纤维肿胀,排列紊乱,空泡变性,有炎症细胞浸润;丹参酮ⅡA磺酸钠组心肌细胞排列趋于整齐,结构接近正常。

图1 各组大鼠心肌组织病理变化(×200)

2.3 各组大鼠心肌 NF-κB、TNF-α mRNA的表达见表2。给药12周后,丹参酮ⅡA磺酸钠组心肌组织中NF-κB、TNF-α mRNA表达较模型对照组明显降低,两组之间差异显著(P<0.05)。

表2 各组NF-κB、TNF-α mRNA比较(±s)

表2 各组NF-κB、TNF-α mRNA比较(±s)

组 别 n NF-кB TNF-α mRNA正常对照组 10 0.33±0.11 0.44±0.10模型对照组 10 0.61±0.21# 0.74±0.25#丹参酮ⅡA磺酸钠组 10 0.43±0.14* 0.51±0.18*

3 讨论

心血管并发症是糖尿病相关的病死率和发病率的主要原因[2]。糖尿病心肌病是一种独立于冠心病及高血压之外的糖尿病心血管并发症[3]。目前认为发病机制复杂,炎症反应可能是其重要发病环节之一[4]。本研究发现,模型对照组大鼠心肌病理学切片显示心肌疏松,淡染,心肌纤维肿胀,排列紊乱,空泡变性,有炎症细胞浸润,提示炎症反应参与了糖尿病心肌病过程。研究发现,NF-κB是对炎症、免疫调节较为敏感的转录因子,活化可产生大量的炎症介质,引起炎症反应的发生。糖尿病大鼠胰岛素抵抗、糖脂代谢异常,导致NF-κB的激活,激活NF-κB信号通路的级联反应,进一步导致氧化应激的增加,从而扩大心肌局部炎症损伤,引起心肌线粒体功能障碍并发心功能不全[5-6]。本研究表明,模型对照组大鼠糖脂代谢明显异常,血TNF-α水平及其心肌NF-κB、TNF-α mRNA表达均显著高于正常组,进一步证实了NF-κB、TNF-α mRNA表达是糖尿病心肌炎症损害重要机制。

研究表明[7],丹参酮ⅡA具有干预炎症反应作用,能够降低左心室心肌中TNF-α的表达以及肥厚心肌细胞中NF-κB的表达,同时通过抗氧化减轻TNF-α对心肌细胞的损伤。本研究病理切片发现,丹参酮ⅡA磺酸钠组心肌细胞排列趋于整齐,结构接近正常。前期研究亦发现丹参酮ⅡA磺酸钠对糖尿病大鼠心功能具有保护作用。上述研究结果提示,丹参酮ⅡA磺酸钠对糖尿病大鼠心肌具有保护作用。本研究中,丹参酮ⅡA磺酸钠组大鼠糖脂水平比模型对照组下降,但差异显示统计学意义,提示丹参酮ⅡA对心肌保护作用是降糖脂外的作用;与模型对照组对比,丹参酮ⅡA磺酸钠组糖尿病大鼠不但循环中TNF-α水平明显降低,心肌中NF-КB、TNF-α mRNA表达也显著降低,这与文献研究基本一致[8]。本研究结果表明丹参酮ⅡA磺酸钠可能通过抑制糖尿病大鼠心肌的NF-кB通路,抑制TNF-α mRNA表达,从而发挥对心肌的保护作用。

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Effect of TanshinoneⅡA Sulfonate Sodium on TNF-α m RNA Expression in Rats w ith Type-ⅡDiabetic M yocardium

YANG Hai-Yu,YU Tao,YANG Ai-Cheng,et al.Jiangmen Wuyi Traditional Chinese Medicine Hospital,Guangdong Province,Guangdong,Jiangmen 529030,China

Objective:To evaluate the effect of tanshinoneⅡA sulfonate sodium on TNF-α mRNA expressions in myocardium of rats with type-Ⅱdiabetics and further discuss the protective mechanism of diabetic cardiomyopathy. M ethods:Wister rats were random ly divided into normal controlgroup(NC),model controlgroup(DM)and tanshinoneⅡA sulfonate sodium treatmentgroup(DMS).After rats model was established and STS was administrated for 12 weeks.Specimens of blood and myocardium in rats were reserved for detecting serum TNF-α by radio immunoassay and expressions of NF-κB(Nuclear factor-kappa B)、TNF-α mRNA in myocardium by RT-PCR.Results:Compared with the NCgroup,the level of TNF-α in DMgroup elevated(P<0.01).Compared with the NCgroup,the NF-κB and TNF-α mRNA expressions in myocardium of DMgroup significantly increased (P<0.01).However,the NF-κB and TNF-α mRNA expressions in myocardium of DMSgroup after 12 weeks treatment were less than those of DMgroup,showing statistical differences (P<0.05).Conclusion:TanshinoneⅡA sulfonate sodium can reduce TNF-α mRNA expressions in myocardium of rats with type-Ⅱdiabetics by inhibition of NF-κB pathway and protect the diabetic rats′myocardium.

Diabetic cardiomyopathy;TanshinoneⅡA sulfonate sodium;TNF-α;NF-κB

R285.5

A

1004-745X(2014)03-0440-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.03.025

2013-12-10)

广东省江门市科技局资助课题(20107514)

△通信作者

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