鞘内预注右美托咪啶对脊髓缺血／再灌注损伤后脊髓水含量、小胶质细胞及基质金属蛋白酶表达的影响

王 赫，李晓倩，马 虹

（中国医科大学附属第一医院麻醉科，辽宁沈阳 110001）

既往研究发现，坐骨神经结扎前鞘内预注右美托咪啶（dexmedetomidine，DEX）能够有效减轻神经病理性疼痛，减少脊髓组织中炎性因子的产生，改善预后［1］。一些研究表明，脊髓缺血／再灌注损伤（spinal cord ischemia reperfusion injury，SCIRI）后，减轻脊髓水肿、维持血脊髓屏障（blood spinal cord barrier，BSCB）的完整性，可以减少SCIRI所致的神经损伤［2］。鞘内预注DEX是否通过抑制SCIRI后小胶质细胞变化和基质金属蛋白酶表达对脊髓水肿产生作用，有待深入研究。本研究采用阻断胸主动脉血流合并系统低血压建立SCIRI模型，探讨鞘内预注DEX对SCIRI后急性脊髓水肿、小胶质细胞、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinases，MMP-9）变化的影响。

1 材料

1.1 实验动物 ♂ Sprague-Dawley大鼠295只，体质量260～280 g，由中国医科大学实验动物中心提供。

1.2 药品和仪器 伊文思蓝（evans blue，Sigma）；兔抗MMP-9多克隆抗体（Santa Cruz）；兔抗 Iba-1单克隆抗体（Wako）；共聚焦荧光显微镜；GLS-700D型数码凝胶扫描分析系统。

2 方法

2.1 实验分组 大鼠随机分为4组。非假手术组参照文献［3］制备SCIRI模型，并行 L5-L6鞘内置管。假手术组（Sham组）：胸主动脉血流阻断前2 d鞘内注射生理盐水30 μl，开胸并暴露胸主动脉而不阻断；SCIRI组（IR组，鞘内注射30μl生理盐水）：胸主动脉血流阻断前2 d鞘内注射生理盐水30μl，暴露胸主动脉并于左锁骨上动脉之间无创动脉夹夹闭14 min；DEX组（鞘内注射右美托咪啶）：胸主动脉血流阻断前2 d鞘内注射右美托咪啶10、30μl，暴露胸主动脉并于左锁骨上动脉之间无创动脉夹夹闭14 min；D+A组（鞘内注射右美托咪啶及其抑制剂阿替美唑）：胸主动脉血流阻断前2 d鞘内注射右美托咪啶10μg+阿替美唑10μg（共30μl），暴露胸主动脉并于左锁骨上动脉之间无创动脉夹夹闭14min。腹腔注射0.3ml氨苄青霉素（0.1 g·L-1）。术后单笼饲养。

2.2 脊髓水肿测定 采用干湿法测定脊髓含水量，评价脊髓水肿。

2.3 伊文思蓝测定血-脊髓屏障完整性 血脊髓屏障通透性测定经耳缘静脉缓慢匀速注射质量浓度为20 g·L-1的伊文思蓝45 mg·kg-1。取出脊髓缺血节段（L4-L6），离心，取上清液，用酶标仪检测（λ＝632 nm）OD值，每个样本重复检测3次。根据标准曲线计算出每克脊髓组织中EB含量（μg·g-1）。

2．4 小胶质细胞标志物Iba-1与MMP-9荧光双标染色

取MMP-9和Iba-1二者都为阳性作为表达MMP-9的小胶质细胞，每个截面（蒙太奇拼接成整个冠状面图）的阳性细胞用Image Pro P1us6.0软件计数3个冠状平面的阳性细胞数量的平均值和平均光密度值（mean optical density，MOD）。

2.5 统计学处理 所有数据结果以s表示。数据处理采用SPSS 12.0统计学软件，采用单因素方差分析（ANOVA）比较组间差异，使用post hoc schaffe tests进行多重比较。

3 结果

3.1 脊髓含水量 与Sham相比，IR组SCIRI后脊髓水含量48h达到最高峰，明显大于12和24 h，48～72 h脊髓水肿无明显变化，自d 5开始脊髓含水量下降，7 d水肿小于5 d（F＝11．03，P＜0.05）；与 IR组相比，DEX组各时点脊髓含水量均明显下降（F＝12.73，P＜0.05，Tab 1）。

3．2 脊髓组织中EB含量 与Sham相比，IR组SCIRI后脊髓组织中EB含量48 h达到最高峰，明显大于12和24 h，48～72 h脊髓水肿无明显变化，自d 5开始脊髓组织中EB含量下降，7 d EB渗出小于5 d（F＝11．93，P＜0.05）；与 IR组相比，DEX组各时点脊髓组织中EB渗出均明显下降（F＝13．13，P＜0.05，Tab 2）。

Tab 1 Spinal water content in each key point time after SCIRI（%，n＝6）

Tab 2 Spinal Evans blue content in each key point time after SCIRI（μg·g-1，n＝4）

Tab 3 Cell numbers of double positive labeled w ith MMP-9／Iba-1 in each key point time after SCIRI（numbers／mm2，n＝6）

3．3 SCIRI后小胶质细胞（Iba-1）与金属基质蛋白酶（MMP-9）荧光双标染色 与Sham相比，IR组再灌注损伤后，脊髓背角Iba-1阳性小胶质细胞开始逐渐增多，于48 h达到最高峰，明显大于12和24 h，自d 5开始Iba-1阳性细胞数量下降，d 7阳性细胞的数量小于 d 5（F＝14．65，P＜0.05）；与IR组相比，DEX组各时点Iba-1阳性细胞的数量均明显减少（F＝12．34，P＜0.05）。阳性细胞数统计分析示SCIRI后表达MMP-9的小胶质细胞数目在12～36 h之间开始增加，在48 h时达到高峰，5 d时已经明显下降（Tab 3）。

4 讨论

SCIRI后血 -脊髓屏障（blood-spinal cord barrier，BSCB）完整性破坏，通透性增加，造成脊髓组织水肿、炎症反应。缺血前鞘内注射DEX可以提高再灌注损伤后BSCB的完整性，减轻脊髓损伤区域的水肿程度，且上述DEX的抗脊髓水肿的机制涉及α2AR的激动，与既往Bell MT等的研究结果一致。

通常正常大鼠脊髓中有少量小胶质细胞。本研究发现SCIRI后损伤的脊髓组织中开始出现呈巨噬细胞样的激活状态下的小胶质细胞，并逐渐增多，加入DEX后在阳性细胞数量明显减少，说明DEX可抑制SCIRI后小胶质细胞的活化，是其发挥神经保护作用的重要因素之一。其保护作用可能通过提高小胶质细内的环磷腺苷水平［4］，调节组织间隙Na+，K+，Ca2+离子稳态以及谷氨酸的转运和释放的平衡［5］，以及选择性抑制p38MAPK信号通路中的p38β亚型而特异性阻断脊髓小胶质细胞的活化［6］。

我们既往研究发现，SCIRI后MMP-9表达表达增加，与脊髓水肿有密切联系。在本研究中，发现DEX能够通过抑制SCIRI后小胶质细胞活化，下调MMP-9蛋白表达从而减轻脊髓损伤部位水肿、减轻脊髓缺血／再灌注损伤，发挥神经保护作用。

参考文献：

［1］ Li X Q，Ma H.Intrathecal injection of Dexmedetomidine reduces neuropathic pain in ratmodel of chronic constriction injury［J］.J Chin Physician，2013，15（9）：1174-8.

［2］ Fang B，Wang H，Sun X J，et al.Intrathecal transplantation of bonemarrow stromal cells attenuates blood-spinal cord barrier disruption induced by spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits［J］.JVasc Surg，2013，58（4）：1043-52.

［3］ Li X Q，Lv H，Tan W F，et al.Role of the TLR4 pathway in blood-spinal cord barrier dysfunction during the bimodal stage after ischemia／reperfusion injury in rats［J］.J Neuroinflammation，2014，11：62.

［4］ Jin Y，Sato K，Tobo A，etal.Inhibition of interleukin-1βproduction by extracellular acidification through the TDAG8／cAMPpathway in mousemicroglia［J］.J Neurochem，2014，129（4）：683-95.

［5］ Schilling T，Eder C.Fluorescence imaging of intracellular Ca2+，Na+，and H+in culturedmicroglia［J］.MethodsMol Biol，2013，1041：147-61.

［6］ Park SY，Jin M L，Kim Y H，et al.Anti-inflammatory effects of aromatic-turmerone through blocking of NF-κB， JNK， and p38MAPK signaling pathways in amyloidβ-stimulated microglia［J］.Int Immunopharmacol，2012，14（1）：13-20.