槲皮素联合顺铂对人骨肉瘤MG-63细胞增殖及凋亡的影响

施剑明，殷嫦嫦，孙维君，杜桂花，林思文，谢荣辉，耿书国，汪建样，殷 明

（南昌大学1.第二附属医院、2.研究生院医学部，江西 南昌 330006；3.九江学院，江西 九江 332000）

槲皮素（quercetin，Qu）是一种天然的黄酮类化合物，广泛存在于植物的花、叶、果实中，具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集及保护心血管等作用［1］。近年来其在抗肿瘤方面的作用成为了研究热点，具有抗肿瘤范围广、价格低廉、对正常细胞几乎无毒副作用等优点［2］。已有研究报道［3-4］Qu具有抗骨肉瘤细胞作用，本研究将联合应用Qu与顺铂（cisplatin，CDDP）作用于MG-63细胞，观察其对MG-63细胞增殖及凋亡的影响，通过Chou-Talaly联合指数法分析两药之间是否具有协同效应，并初步探讨其作用机制，为Qu运用于骨肉瘤的临床治疗提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人骨肉瘤MG-63细胞株（由南昌大学第一附属医院烧伤研究所馈赠，本实验室冻存储备）。

1.1.2 药品与试剂 槲皮素（美国Sigma）；顺铂注射液（江苏豪森药业）；高糖培养基、胎牛血清（美国Hyclone公司）；引物合成（南京金斯瑞生物科技有限公司）；兔抗人 β-actin、Bcl-2、cleaved caspase-3多克隆抗体（美国 Proteintech）；DMSO、ANNEXIN VFITC凋亡检测试剂盒（北京Solarbio公司）；CCK-8细胞增殖检测试剂盒（上海经科化学科技有限公司）；GREENspin细胞RNA快速提取试剂盒（北京庄盟国际生物基因科技有限公司）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗、HiFi-MMLV cDNA逆转录试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、高灵敏度化学发光检测试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）；2×Taq Master Mix（上海欣百诺生物科技有限公司）；总蛋白提取试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）。

1.1.3 仪器 倒置相差显微镜（日本Nikon公司）；PCR基因扩增仪（西安天隆科技有限公司）；Mini水平电泳槽、垂直电泳槽、转移电泳槽、酶标仪-Model680（美国BIO-RAD公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；凝胶成像分析系统、CO2恒温培养箱（美国SIM公司）。

1.2 方法

1.2.1 药物作用后细胞形态学观察 取对数生长期MG-63细胞，常规消化后，计数，调整细胞密度，按5×104／孔，接种于24孔培养板，待细胞汇合约70%后加药。实验设：①不同浓度Qu组（分别给予10、20、40、80、160μmol·L-15个浓度处理）；② 不同浓度 CDDP组（分别给予 1.5625、3.125、6.25、12.5、25μmol·L-15个浓度处理）；③ 不同浓度联合组（按两组单药浓度梯度依次平行组合）；④对照组（药物浓度为0）；其中各组DMSO浓度均控制在0.1%。作用1、2、3 d后观察细胞形态及密度的变化情况。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖抑制率 取对数生长期MG-63细胞，常规消化后，计数，调整细胞密度按5×103／孔，接种于96孔培养板，待细胞汇合约70%后加药。按上述浓度设置将不同浓度的Qu、CDDP单独及联合加入各孔，每个浓度梯度设4个平行孔及药物空白孔（去除药物溶液自身颜色对测定的影响），并设添加0.1%DMSO完全培养基的对照组，作用48 h后每孔加入20μl CCK-8，细胞培养箱内孵育2 h后，取出在酶标仪450 nm处测定其吸光度值（A），以药物空白孔进行调零，根据计算公式：细胞增殖抑制率／%计算不同浓度Qu与CDDP单独及联合对细胞的抑制率，并计算各组药物的半数抑制率浓度IC50。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率 取对数生长期MG-63细胞常规消化后，计数，调整细胞密度按1×105／孔，接种于6孔培养板，待细胞汇合约70%后加药。实验设对照组（含0.1%DMSO，药物浓度为0）、Qu组（含0.1%DMSO及IC50Qu）、CDDP组（含0.1%DMSO及 IC50CDDP）、Qu+CDDP组（含0.1%DMSO、IC50Qu及 IC50CDDP），其中 IC50为药物作用48 h后的半数抑制率浓度。药物作用细胞48 h后，常规消化调整细胞密度达1×109·L-1，取1 ml细胞悬液，用预冷PBS洗涤离心2遍，加入200 μl Binding Buffer，然后加入 10μl Annexin V-FITC，室温避光反应15 min后加入300μl Binding Buffer，上机前5 min加入10μl PI，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。分布于散点图左下象限散点代表正常细胞，右下象限的散点代表早期凋亡细胞，右上象限的散点代表晚期凋亡细胞和坏死细胞，左上象限散点代表细胞碎片。

1.2.4 RT-PCR检测凋亡相关分子基因表达水平细胞种板及药物分组与流式细胞仪检测凋亡率相同，药物作用48 h后，按GREENspin细胞RNA快速提取试剂盒说明书提取各组细胞总RNA，按HiFi-MMLV cDNA第1链合成试剂盒说明书逆转录成cDNA，然后按2×Taq Master Mix说明书进行PCR扩增，扩增后DNA样本用1%琼脂糖凝胶进行电泳。采用SIM凝胶成像系统对条带进行照相，Image-Proplus6.0软件进行灰度分析。反应所需引物序列为 β-actin：上游CGGGAAATCGTGCGTGAC-′，下游′-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′，产物大小 443 bp；Bcl-2：上游′-ACCTTCATCAGGGGGTG-′，下游′-TGCCAGTGGTCACACG-3′，产物大小 122 bp；caspase-3：上游 5′-CATGATTAGCAAGTTACAGTGATGC-3′，下 游 5′-CACAGTCTTAAGTGGGGGGA-3′，产物大小 110 bp。

1.2.5 Western blot检测凋亡相关分子蛋白表达水平 细胞种板及药物分组与流式细胞仪检测凋亡率相同，药物作用48 h后，按总蛋白提取试剂盒说明书提取各组总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，每孔蛋白上样30μg，进行SDS-PAGE凝胶电泳，湿转法转膜至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭2 h，TBST稀释一抗（β-actin 1∶4 000，Bcl-2 1∶1 000，cleaved caspase-3 1∶800）4℃孵育过夜，次日5%脱脂牛奶稀释，二抗（1∶5 000）室温孵育2 h，于暗室按高灵敏度化学发光检测试剂盒说明书滴加发光工作液，暗盒中胶片曝光，显影、定影后用相机拍照，采用Image-Proplus 6.0软件进行灰度分析。

1.2.6 统计学处理及药物联合作用分析 采用SPSS 19.0软件进行统计处理，所有数据采用表示，组间比较采用单因素方差分析，并通过Scheffe检验进行两两比较。药物联合作用分析：采用Chou-Talaly联合指数法进行判断［5］，根据中效方程式 fa／fu＝（D／Dm）m（其中 fa为药物作用效应，D为药物浓度，Dm为中效浓度IC50），两边取对数得lg（fa／fu）＝mlgD-mlgDm，设 y＝lg（fa／fu），x＝lgD，a＝-mlgDm，m＝b由此得到直线方程式：y＝bx+a，可做出两药单独及联合作用时的中效图形，并计算相关系数γ，得出m及Dm，再计算出两药单独及联合作用在各效应所需药物浓度 D＝Dm（fa／fu）1／m。最后计算两药联合作用在各效应（fa）的合用指数（Combination index，CI），CI＝D1／DX1+D2／DX2+α*D1D2／DX1DX2，其中 D1、D2为两药联合作用产生 X效应时两药各自所需浓度，DX1、DX2为两药单独作用产生X效应时两药各自浓度，α为常数，当两药联合作用相互排斥时为0，当两药物联合作用相互非排斥时为1。Qu和CDDP相互作用为非排斥性，故α＝1。CI＜1，两药联合呈协同效应；CI＝1，两药联合呈叠加效应；CI＞1两药联合呈拮抗效应。

2 结果

2.1 细胞形态学观察结果 对照组MG-63细胞增殖良好，Qu组及CDDP组细胞数量减少，部分细胞形态由梭形变圆、变小，细胞质内颗粒增大增粗，并可见少量凋亡小体，少量细胞逐渐脱落、裂解，呈典型凋亡形态改变，联合组凋亡现象更加明显。上述现象随着作用时间的延长及药物浓度的增加而增强（Fig 1）。

Fig 1 Cellular morphology observation（×100）A：0.1%DMSO for 48 h；B：40μmol·L-1 Qu for 48 h；C：6.25μmol·L-1 CDDP for 48 h；D：40μmol·L-1 Qu combined with 6.25μmol·L-1 CDDP for 48 h.

2.2 细胞增殖活力检测及药物联合作用分析结果

Qu、CDDP单独及联合均对MG-63细胞增殖有抑制作用（P＜0.05），且随着药物浓度的增加抑制作用增强；与两药单独作用相比较，联合作用更加明显（P＜0.05）（Tab 1）。在中效方程中，通过 y＝bx+a直线回归方程可得到Fig 2中的中效图形，并计算出Tab 2中的相关数据，最后得到Qu与CDDP联合在不同效应（fa）时的合用指数（CI），绘制出量效曲线（fa-CI）（Fig 3），Qu与 CDDP联合几乎在整个效应范围内（0.1～0.9）都存在CI＜1，表明Qu与CDDP联合呈明显协同效应。

Tab 1 Inhibiton ratios of Qu alone or combined w ith CDDP on grow th of MG-63 cell

Tab 1 Inhibiton ratios of Qu alone or combined w ith CDDP on grow th of MG-63 cell

*P＜0.05 vs control；#P＜0.05 vs Qu alone at the same concentration gradient；△P＜0.05 vs CDDP alone at the same concentration gradient.

Concentration gradient Qu Concentration／μmol·L-1 Inhibitory Inhibitory Inhibitory ratio／%CDDP Concentration／μmol·L-1ratio／%Qu+CDDP Concentration／μmol·L-1ratio／%0 0 0 0 0 0 0 10 8.80±2.87* 1.5625 7.02±1.94* 10±1.5625 30.07±6.58*#△2 20 13.47±1.87* 3.125 10.91±1.26* 20±3.125 48.78±3.31*#△3 40 39.64±2.73* 6.25 22.83±2.40* 40±6.25 62.92±2.34*#△4 80 61.58±1.68* 12.5 55.01±1.59* 80±12.5 87.42±3.80*#△5 160 72.61±4.31* 25 71.71±1.18* 160±25 90.20±2.38*#1△

Tab 2 m，Dm andγof Qu alone or combined w ith CDDP

Fig 2 M edian-effect graph of Qu alone or combined w ith CDDP

Fig 3 Curve of fa and CI after treated with Qu and CDDP（fa-CI）

2.3 细胞凋亡率检测结果 Qu组及CDDP组细胞早期凋亡率分别为（4.96±1.14）%、（8.44±0.72）%，与对照组（0.81±0.34）%的细胞早期凋亡率比较有所升高（P＜0.05），而Qu+CDDP组细胞早期凋亡率高于对照组及各单药组（P＜0.05），为（11.52±1.09）%（Fig 4）。

2．4 凋亡相关分子mRNA含量检测结果 RTPCR检测结果灰度分析表明：Qu和CDDP作用后均可下调Bcl-2及上调caspase-3基因表达水平（P＜0.05），而 Qu+CDDP作用时变化更加明显（P＜0.05）（Fig 5）。

Fig 4 Apoptosis ratios of MG-63 cells in different groupControl：0.1%DMSO；Qu：65.35μmol·L-1；CDDP：12.70 μmol·L-1；Qu+CDDP：65.35μmol·L-1 Qu combined with 12.70 μmol· L-1 CDDP.The apoptosis ratios of MG-63 cells in different groups were analyzed by flow cytometry after48 h.*P＜0.05 vs control；#P＜0.05 vs Qu；△P＜0.05 vs CDDP.

2.5 凋亡相关分子蛋白含量检测结果 Westernblot检测凋亡相关分子 Bcl-2、cleaved caspase-3（caspase-3活性片段）蛋白水平变化与基因水平变化一致（Fig 6）。

3 讨论

CDDP是骨肉瘤化疗方案中的一线用药，是一种以浓度决定疗效的药物，然而长时间大剂量使用可造成严重毒性积累以及内在性和获得性耐药等问题，很大程度上限制了其大量使用。寻找一种无毒或低毒的中药成分，与传统化疗药物联合应用，利用两者之间的协同效应，在保证化疗药物杀灭肿瘤细胞效果的同时降低化疗药物的使用剂量，从而减小药物的毒副作用及延缓耐药的产生，是近年来研究的热点。Qu是目前已知的最强的中药抗癌有效成分之一，对肺癌细胞［6］、乳腺癌细胞［7］、胃癌细胞［8］、白血病细胞［9］、肝癌细胞［10］等多种肿瘤细胞均有抑制作用。然而Qu联合CDDP是否具有协同抗骨肉瘤作用尚未见报道。

Fig 5 Gene expression of Bcl-2 and caspase-3 indifferent groupControl：0.1%DMSO；Qu：65.35μmol·L-1；CDDP：12.70 μmol·L-1；Qu+CDDP：65.35μmol·L-1 Qu combined with 12.70 μmol·L-1 CDDP.The gene expression of Bcl-2 and caspase-3 was detected by RT-PCR assay after 48 h.*P＜0.05 vs control；#P＜0.05 vs Qu；△P＜0.05 vs CDDP.

Fig 6 Protein expression of Bcl-2 and cleaved caspase-3 in different groupControl：0.1%DMSO；Qu：65.35μmol·L-1；CDDP：12.70 μmol·L-1；Qu+CDDP：65.35μmol·L-1 Qu combined with 12.70 μmol·L-1 CDDP.The protein expression of Bcl-2 and cleaved caspase-3 wasmeasured by Western blot assay after 48 h.*P＜0.05 vs control；#P＜0.05 vs Qu；△P＜0.05 vs CDDP.

本文采用的Chou-Talaly联合指数法是基于质量作用定律的中效原理提出的，目前已在国际上被广泛应用于肿瘤等领域药物联合分析［11］，具有周期短，操作相对简单，结果明确，应用MTT或CCK-8实验所得结果就可以进行分析等优点。本实验分析结果显示，Qu、CDDP联合对骨肉瘤增殖抑制作用在不同效应水平（0.1～0.9）均呈协同效应，提示槲皮素可作为CDDP辅助用药用于骨肉瘤的临床化疗。

槲皮素抗肿瘤的机制呈多样性，主要包括：抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制信号转导、影响肿瘤细胞代谢和抑制肿瘤侵袭转移等［12］，其中诱导肿瘤细胞凋亡是最主要的机制之一，其中涉及到许多抗凋亡基因和促凋亡基因。Bcl-2是公认的抗凋亡基因，具有稳定线粒体外膜的作用，主要通过阻止线粒体细胞色素C的释放而发挥抗凋亡作用［13］。谭君等［14］研究发现，槲皮素可通过下调 survivin、Bcl-2蛋白的表达而诱导肺癌A549细胞的凋亡。Kim等［15］用槲皮素处理结肠癌HT-29细胞后，同样检测到Bcl-2表达下降。Caspase家族是引起细胞凋亡形态学和生物学改变的关键执行者，所引发的级联反应是细胞凋亡过程的中心环节，其中caspase-3是核心效应器［16］，当细胞受到凋亡信号刺激后，无活性前体pro-caspase-3被激活剪切，形成活性片段cleaved caspase-3，后者再瀑布式激活下游的caspase蛋白酶家族，进一步参与切割多种死亡底物，最终诱导细胞凋亡。顾超等［17］研究槲皮素诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡实验中，证实其能够通过活化caspase-3、caspase-8促进细胞凋亡，且存在明显的时间依耐性。谭君等［18］还发现槲皮素可通过下调survivin蛋白的表达，直接激活caspase-3而诱导肝癌SMMC7721细胞凋亡。本研究结果显示槲皮素和顺铂作用MG-63细胞后，Bcl-2表达下调，而caspase-3表达上调，联合用药变化较单独用药更加明显，从而推测槲皮素联合顺铂协同抗骨肉瘤作用机制可能与相互增强下调Bcl-2及上调caspase-3等凋亡相关分子的表达有关。

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