新疆维吾尔族非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体及KRAS基因突变与临床病理特征的关系

马 玲，阿里木江·赛提瓦尔地，单 莉，张 黎，刘春玲，韩志刚

（1.新疆医科大学附属肿瘤医院肺内一科，新疆乌鲁木齐，830011；2.新疆乌鲁木齐市中医医院肿瘤内科，新疆乌鲁木齐，830002；3.新疆医科大学附属肿瘤医院肺内二科，新疆乌鲁木齐，830011）

新疆维吾尔族非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体及KRAS基因突变与临床病理特征的关系

马 玲1，阿里木江·赛提瓦尔地1，单 莉1，张 黎2，刘春玲3，韩志刚1

（1.新疆医科大学附属肿瘤医院肺内一科，新疆乌鲁木齐，830011；2.新疆乌鲁木齐市中医医院肿瘤内科，新疆乌鲁木齐，830002；3.新疆医科大学附属肿瘤医院肺内二科，新疆乌鲁木齐，830011）

目的探讨新疆维吾尔族非小细胞肺癌（NSCLC）患者组织中表皮生长因子受体（EGFR）及KRAS基因突变与临床病理特征的关系。方法应用探针扩增阻滞突变系统（ARMS）检测50例NSCLC组织中EGFR基因第18、19、20和21外显子及KRAS基因12、13密码子上7种热点体细胞的突变情况，分析EGFR及KRAS基因突变与维吾尔族NSCLC患者临床病理特征之间的相关性。结果50例标本中，EGFR总检出率为12.0%，其中4例为19外显子缺失突变，2例为21外显子L858R点突变；KRAS总检出率为10%，均位于12密码子Gly12Ala突变；无1例发生EGFR与KRAS同时突变。腺癌、鳞癌、大细胞癌EGFR及KRAS基因突变检出率分别为27.8%、3.5%、0%和22.2%、3.5%、0%。腺癌患者EGFR基因突变率（27.8%）明显高于非腺癌者（3.1%），差异有统计学意义。腺癌与非腺癌患者KRAS基因突变比较，差异有统计学意义。维吾尔族患者EGFR及KRAS基因突变与年龄、性别、吸烟状况、TNM分期及ECOG评分均无关。结论与汉族人群相比，新疆维吾尔族NSCLC患者EGFR突变率较低，KRAS突变率较高，类似于欧美高加索人群的突变特点。

维吾尔族；表皮生长因子受体；KRAS；基因突变

肺癌是发病率及死亡率均居首位的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（NSCLC）最常见，约占总数80%，而NSCLC中85%以上患者属于中晚期，丧失了根治性手术治疗的最佳机会［1-2］。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFRTKIs）对部分NSCLC患者具有高效、低毒的良好疗效，但并非所有患者都表现出良好的效果。因此，寻找能够预测EGFR-TKI药物敏感性的预后指标非常重要。NSCLC中最常见的2个突变基因分别编码表皮生长因子受体（EGFR）和KRAS。EGFR基因突变位点主要是19外显子缺失突变及21外显子的L858R点突变，与TKI药物疗效呈正相关。KRAS基因是一种原癌基因，突变位点主要集中在12及13位密码子上，其突变患者对EGFR-TKI疗效差，提示预后不良［3-4］。由于这种基因突变与TKI药物的敏感性及耐药性相关，因此检测NSCLC患者肿瘤组织中2种基因的表达，有助于为肺癌患者提供精确的个体化治疗。目前，国内外对新疆维吾尔族NSCLC患者关于基因突变的研究较为罕见。为进一步了解新疆当地民族NSCLC患者的EGFR及KRAS突变情况，本研究对本院维吾尔族NSCLC患者组织标本进行EGFR及KRAS基因检测，旨在分析突变状态与临床病理特征的关系。

1 材料与方法

1.1 一般材料

收集2003年1月—2011年12月本院保存的晚期维吾尔族NSCLC患者的组织蜡块50例。经病理证实，诊断明确。其中男39例，女11例；年龄21～75岁，中位年龄57.9岁；TNM分期：Ⅲa期2例，Ⅲb期26例，Ⅳ期22例；功能状态评分（PS）评分：0～1分28例，2分18例，＞3分4例；组织学类型：鳞癌29例，腺癌18例，大细胞癌3例；既往经过化疗和／或放疗和／或介入治疗45例，未经过任何抗肿瘤治疗5例。

1.2 方法

1.2.1 取材：所有病理标本在4%中性甲醛液中固定，经石蜡包埋，常规HE染色，筛选出肿瘤成分＞80%的瘤组织块切片。

1.2.2 基因检测：检测内容为肺癌EGFR基因18、19、20、21外显子，主要研究对象为19和21外显子，肺癌KRAS基因12、13密码子上7种热点体细胞突变。检测方法：探针扩增阻滞突变系统（ARMS）又名等位基因特异聚合酶链反应（AS -PCR）。检测试剂采用厦门艾德生物医药科技有限公司生产的人类EGFR基因突变检测试剂盒及人类KRAS基因7种突变检测试剂盒，实验具体操作步骤参照试剂盒说明书进行。采用StrataGene MX3000P实时PCR仪进行扩增，每次检测样品包括1个阳性质控品、1个NTC对照。如果Ct值为0或Ct值＞30，则实验结果为野生型。PCR反应条件：95℃预变性5 min，1个循环；95℃变性25s，64℃退火20s，72℃延伸20 s，15个循环；93℃变性25 s，60℃退火35 s，72℃延伸20 s，31个循环。

2 结果

2.1 EGFR与KRAS基因突变检测结果

EGFR总检出率为12.0%（6／50），其中4例为19外显子缺失突变，突变率为8%（4／50），2例为2l外显子L858R点突变，突变率为4%（2／50）。未检测到18及20外显子突变。KRAS总检出率为10%（5／50），均位于12密码子Gly12Ala突变。

2.2 EGFR与KRAS基因突变的关系

50例标本中，无1例发生EGFR与KRAS同时突变。6例EGFR基因突变标本未检测到KRAS基因突变，而5例KRAS基因突变标本也未检测到EGFR基因突变。

2.3 EGFR及KRAS基因突变与临床病理特征的关系

腺癌、鳞癌、大细胞癌EGFR基因突变检出率分别为27.8%（5／18）、3.5%（1／29）、0%（0／3），腺癌患者EGFR基因突变率明显高于鳞癌（P＜0.05）。腺癌EGFR基因突变率为27.8%，非腺癌突变率为3.1%，二者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。维吾尔族患者EGFR基因突变与年龄、性别、吸烟状况、TNM分期、ECOG评分均无关（P＞0.05），而与病理类型显著相关（P＜0.05）。见表1。

表1 维吾尔族NSCLC患者EGFR基因突变与临床病理特征的关系［n（%）］

表2 维吾尔族NSCLC患者KRAS基因突变与临床病理类型的关系［n（％）］

腺癌、鳞癌、大细胞癌KRAS基因突变检出率分别为22.2%（4／18）、3.5%（1／29）、0%（0／3），腺癌患者KRAS基因突变率明显高于鳞癌及其他组织类型（P＜0.05）。腺癌与非腺癌KRAS基因突变比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。KRAS基因突变与年龄、性别、吸烟状况、TNM分期及ECOG评分均无关（P＞0.05），而与病理类型显著相关（P＜0.05）。见表2。

3 讨论

研究［5］显示，EGFR在40%～89%的NSCLC中表达，其在肿瘤的形成及生物学行为上发挥重要的作用，目前是NSCLC治疗的重要靶点之一。EGFR基因位于人类第7号染色体短臂上，由188 307个碱基组成，包括28个外显子，主要突变位点为外显子18、19、20、21，常见于外显子19缺失突变和外显子21 L858R突变，与小分子TKIs的敏感度相关［6］。通过分子水平检测EGFR基因突变状态，为晚期NSCLC患者进行EGFR-TKI治疗已成为定论［7-8］。研究［9］表明，EGFR突变率在亚洲人群较高（30%～50%），高加索人群较低（＜10%）。目前，绝大多数研究以亚洲、欧美人群实验数据为主，而关于中东及中亚地区的研究却很少见。研究［10］表明，汉唐时期，匈奴、吐蕃、汉人、突厥等民族进入今天的新疆地区，融合形成现在的维吾尔族，故维吾尔族属于罗马人种，被归于高加索人群。本研究中，维吾尔族患者EGFR基因突变率为12.0%，与亚洲人群EGFR基因高突变率相比有明显差异，接近于欧美人群的突变水平，这与高加索人群EGFR基因突变率较低结果相一致［9］，同时也是导致维吾尔族患者经过TKI治疗效果差的原因之一。

除人种差别之外，地域因素也对EGFR突变有一定影响。欧美地区高加索人群肺癌患者EGFR突变率仅不到10%，而东亚地区突变率高达50%，证明肺癌的发生受环境因素和遗传学背景的影响。新疆维吾尔自治区是以维吾尔族为主体的少数民族聚居地区，各民族之间在遗传、人种、文化饮食、生活习惯、住所等各个方面存在差异。本研究结果显示，维吾尔族患者EGFR突变总检出率为12%，其中腺癌患者突变率（27.8%）明显高于非腺癌者（3.1%）；患者EGFR基因突变与年龄、性别、吸烟状况、TNM分期及ECOG评分均无关，这与EGFR基因突变与吸烟史、性别相关结果［9］相悖，考虑可能与样本量小，2组样本量明显不平衡有关。本研究结果显示，EGFR基因突变主要类型为外显子19缺失突变，突变率为8%，外显子21 L858R点突变率为4%，二者间无显著差异，原因可能在于本研究入组样本量少，无法进一步明确当地民族EGFR主要的突变类型。

RAS基因被激活后就成为具有致癌活性的癌基因，其突变多发生在N端第12、13密码子上。KRAS是介导EGFR下游信号活化的信号通路，当其发生点突变，就会导致蛋白异常表达，造成细胞恶性增殖病变，最终导致肺癌的发生。KRAS突变被认为是预后不良的分子生物标记物［11］。研究［12］发现，美国和澳大利亚肺癌患者KRAS突变率明显高于中国台湾和日本，欧美人群KRAS突变率为20%～40%，其中肺腺癌占30%～56%，鳞癌占0～25%，大细胞肺癌占8%～33%，腺鳞癌约8%～11%。早年有学者报道KRAS突变与吸烟状况、病理组织学分型及淋巴结转移情况有统计学差异，其中吸烟的腺癌患者突变率较高。而中国台湾的一项研究［13］显示，237肺癌患者标本中，KRAS突变率仅为3.8%，其中腺癌为5.03%，鳞癌为1.56%，说明东亚人和西方人KRAS突变率有显著差异。种族及地域的不同，导致NSCLC患者KRAS基因突变情况可能差异较大［14-15］。本研究结果显示，50例标本中，腺癌、鳞癌、大细胞癌KRAS基因突变检出率分别为22.2%、3.5%、0%；腺癌与非腺癌KRAS基因突变比较，差异有统计学意义；维吾尔族患者KRAS突变率（10%）明显高于亚洲人群（3.8%），印证了维吾尔族属于高加索人群的种族特点。

EGFR和KRAS突变与病理类型、性别及地域相关，TKI药物治疗的优势人群为不吸烟、亚裔、女性及腺癌患者。通过TRIBUTE及BR.21等大型临床研究［15］证实，KRAS突变更多见于男性和吸烟患者。本研究结果显示，KRAS基因突变状态与患者性别、吸烟状况无关，考虑与标本量少，且不吸烟患者明显多于吸烟患者有关。KRAS总检出率为10%，均位于12密码子Gly12Ala突变，与60%～80%的KRAS突变位于12号密码子上的结果相一致。EGFR及KRAS基因不会同时存在于同1例患者中，二者相互排斥，这可能与EGFR传导通路下游的KRAS MARK信号途径相关。本研究也未发现2种基因突变同时出现的患者。

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Relationship between the mutation of epidermal growth factor receptor and KRAS genes and clinical pathological features in Uyghur patients with non-small cell lung cancer in Xinjiang

MA Ling1，ALIMUJIANG·Saitiwaerdi1，SHAN Li1，ZHANG Li2，LIU Chunling3，HAN Zhigang1
（1.First Department of Pulmonary Medicine，The Affiliated Tumor Hospital of Xinjiang Medical University，Urumchi，Xinjiang，830011；2.Department of Oncology，Urumchi Hospital of Traditional Chinese Medicine，Urumchi，Xinjiang，830002；3.Second Department of Pulmonary Medicine，Affiliated Tumor Hospital of Xinjiang Medical University，Urumchi，Xinjiang，830011）

ObjectiveTo explore the relationship between the mutation of epidermal growth factor receptor（EGFR）and KRAS genes and clinical pathological features in Uyghur patients with non-small cell lung cancer（NSCLC）in Xinjiang.MethodsThe mutations of EGFR gene exons 18，19，20 and 21 as well as 7 sorts of hot somatic cells in KRASgene codons 12 and 13 in 50 NSCLC tissues were detected by probe amplification refractory mutation system，and the correlation between the mutation of EGFR and KRAS genes and clinical pathological features in Uyghur patients was analyzed.ResultsAmong 50 specimens，the total detection rate of EGFR was 12.0%，in which 4 belonged to deletion mutantion of exon 19，and 2 to L858R point mutation of exon 21.The total detection rate of KRAS was 10%，all of which belonged to Gly12Ala mutation on codon 12.No one simultaneously occurred EGFR and KRAS mutations.The detection rates of EGFR and KRAS genes in adenocarcinoma，squamous carcinoma and large cell carcinoma were2 7.8%，3.5%，0%and 2 2.2%，3.5%，0%respectively.Themutation rateof EGFRin patients with adenocarcinoma（27.8%）was significantly higher than those without adenocarcinoma（3.1%）.There was significant difference of the KRASgene mutation between patients with／without adenocarcinoma.The mutations of EGFR and KRAS genes in Uyghur patients were not related to the age，gender，smoking，TNM staging and ECOG score.ConclusionCompared with Chinese population，the mutation rate of EGFR in Uyghur patients with NSCLC is lower，but that of KRASis higher，similar to the mutation of European Caucasian population.

Uyghur；epidermal growth factor receptor；KRAS；gene mutation

R 734.2

A

1672-2353（2014）05-030-04

10.7619／jcmp.201405010

2013-11-27

新疆乌鲁木齐市科学技术计划项目（Y111310025）

韩志刚，E-mail：1378213986＠qq.com