灭幽汤对幽门螺杆菌相关性胃炎小鼠胃黏膜组织TLR2、NF-κBp65的影响

王小娟，尹 姣，郭建生，喻 斌*，杜中华，罗 燕，夏 蓉

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

灭幽汤对幽门螺杆菌相关性胃炎小鼠胃黏膜组织TLR2、NF-κBp65的影响

王小娟1，尹 姣2，郭建生2，喻 斌2*，杜中华2，罗 燕2，夏 蓉2

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

目的 探讨灭幽汤对幽门螺杆菌相关性胃炎（HAG）小鼠胃黏膜组织Toll样受体2（TLR2）、核转因子p65（NF-κBp65）的影响。方法 将BALB/c小鼠随机分为正常对照组、模型组、胃三联组、灭幽汤组。采用复合因素（肥甘食物+湿热环境+幽门螺杆菌）建立BALB/c小鼠HP相关性胃炎脾胃湿热证模型。采用免疫组化法检测胃黏膜组织TLR2、NF-κBp65的蛋白表达情况。结果 小鼠模型组与正常对照组比较TLR2与NF-κBp65表达均增加（P＜0.05）；与模型组比较，灭幽汤组小鼠胃黏膜TLR2与NF-κBp65表达均降低(P＜0.05)。结论 灭幽汤能根除HP，可减轻HP引起的胃黏膜炎症反应。其机制可能是通过下调TLR2，抑制NF-κBp65的激活，从而阻止NF－κB的活化，减轻胃粘膜炎症反应，进而发挥其治疗作用。

幽门螺杆菌；胃炎；灭幽汤；Toll样受体2；核转因子p65

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)是一种革兰氏阴性细菌，寄居于人的胃黏膜中。作为一种环境致病因素，HP感染是引起胃炎、消化性溃疡和胃癌的主要因素，对人类健康构成严重危害[1-4]。因此，根除HP成为治疗幽门螺杆菌相关性胃炎（HAG）的重要课题。灭幽汤是临床治疗HAG的有效复方[5-12]，本研究在前期研究的基础上，进一步从分子生物学角度探讨灭幽汤对HAG小鼠胃组织的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级BALB/c小鼠56只，雌雄各半，8周龄，体质量（20±5）g，小鼠购进后常规饲养，室温(20±2)℃，照明昼夜交替时间为12 h∶12 h，自由饮水、进食，适应性喂养3 d，饮食饮水正常、无不良反应者，即纳入实验。动物购自南京君科生物科技有限公司。实验动物质量合格证号：0017145，许可证号：SCXK（苏）2011-0003。

1.1.2 HP菌菌种 悉尼标准菌株 （Sydney strain 1，SSI)，SSI含有细胞毒素相关基因(cagA)蛋白和空泡细胞毒素(vacA)，浓度为HP菌液1×109cfu/mL，由湖南中医药大学基础医学院病原免疫学教研室提供。

1.1.3 实验造模饲料 普通饲料由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，高糖高脂饲料（普通饲料+ 8%蜂蜜+12%猪油）由湖南斯莱克景达实验动物有限公司代加工。

1.1.4 药物 中药：灭幽汤 （黄芩15 g，蒲公英20 g，陈皮10 g，青皮10 g，白及10 g，三七6 g，乌贼骨15 g），以上饮片均购于湖南省药材公司饮片加工厂，饮片浸泡30 min后，加水没过药面5 cm，武火煎至沸腾后改文火，继续煎煮20 min，取汁另置。继续加水，煎煮沸腾后，文火续煎20 min，取汁。两次药汁合并后浓缩至含生药2 g/mL，并用离心机去除药汁中残渣，4℃保存。胃三联西药：枸橼酸铋钾由丽珠医药出厂，生产批号：1212248。替硝唑由山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司出厂，国药准字：H20033090。克拉霉素由杭州中美华东制药有限公司出厂，国药准字：H10970216。按照小鼠与人临床用药剂量、体型系数公式dB=dA×RB/RA×(WA/ WB)1/4计算小鼠用药剂量，胃三联组小鼠用药剂量均为279.8 mg/kg（参考60 kg成人剂量，成人每次用药剂量为铋剂220 mg＋替硝唑500 mg＋克拉霉素250 mg，2次/d），灭幽汤组用药剂量为12.4 g/kg。

1.1.5 试剂 胶体金法HP检测试剂盒，艾康生物技术 （杭州）有限公司。一抗兔抗鼠核转因子p65（NF-κBp65）（批号BA0610）、Toll样受体2（TLR2）（批号BA1716），均购自武汉博士德生物工程有限公司，生物素标记二抗试剂盒（批号sp9002），购自北京中杉金桥生物技术有限公司。常规化学试剂购自北京化学试剂公司，逆转录试剂盒购自Fermentas公司。

1.1.6 仪器 民桥电子天平；中科美菱-80℃冰箱；eppendorf台式冷冻离心机；英国Shandon 325型石蜡切片机；德国LEICA LEICA DM LB2型双目显微镜；麦克奥迪实业集团公司Motic B5显微摄像系统。自制人工湿热箱：已获得专利，专利号：201320293029.4。

1.2 方法

1.2.1 分组与造模 将56只BALB/c小鼠按体质量分层随机分为正常对照组、模型组、胃三联组、灭幽汤组，每组14只。正常对照组予以普通饲料正常饲养，模型组、胃三联组、灭幽汤组予以高脂饲料饲养10 d，然后放入人工湿热箱[温度(35±2)℃，湿度95%±1%]内继续高脂饲料喂养，于第16天以浓度为1×109cfu/ml HP混悬液0.3 mL/只灌胃。灌胃前24 h禁食不禁水，灌胃前4 h禁水，灌胃后4 h给食水。隔日感染1次，连续感染3次。感染后定植2周。2周后所有小鼠均断尾取血以胶体金法检测HP；抽样取胃黏膜做病理切片观察炎症情况，以及电镜下观察HP定植情况。

1.2.2 给药及样本处理 灭幽汤和胃三联组在模型成功后开始给药，每天灌胃1次，其它组分别灌等量的蒸馏水。给药后两周禁食禁水24 h后所有小鼠断尾取血用于通过胶体金法检测HP，采用颈椎脱臼法处死所有小鼠，将BALB/c小鼠仰卧位固定于鼠板，迅速取出胃标本。取胃前，将幽门部和贲门部结扎，在两结扎线的两端切断食道及十二指肠，摘下全胃。沿胃大弯剖开，用冰生理盐水冲洗干净。每组按随机数字表法随机抽取4个胃组织标本，全部放入40 g/L多聚甲醛中4℃固定24 h，石蜡包埋，备做免疫组化检测。

1.2.3 指标检测及方法 （1）胶体金法检测HP，电镜下、光镜下分别观察HP定植情况及 HE染色观察胃黏膜炎症程度。（2）免疫组化检测TLR2、NF-κBp65蛋白表达：将小鼠胃组织石蜡切片放入二甲苯5 min×3次，然后依次经梯度酒精脱蜡至水，并用PBS清洗5 min×3次；浸入3%H2O2去离子水室温孵育10 min，来阻断内源性过氧化物酶活性；蒸馏水冲洗，2 min×3次；65℃烤片2 h后，常规脱蜡至水；高温柠檬酸盐修复20 min；放入3%H2O2溶液中浸泡10 min灭活内源性过氧化物酶；0.01 M PBS洗3 min×2次；滴加 100 μL正常山羊血清封闭15 min，倾去溶液；分别加入一抗兔抗鼠TLR2、NF-κBP65，4℃孵育过夜；0.01 M PBS洗 3 min×2次；加入通用型生物素标记二抗100 μL，37℃30 min，0.01 M PBS洗3 min×2次；加入过氧化物酶标记链霉卵白素100 μL，37℃ 20 min，0.01 M PBS洗3 min×2次；滴加DAB显色剂3~5 min，梯度酒精脱水，中性树胶封片。样本图像采用CMIAS真彩色病理图像分析系统进行分析。每个样本随机选取5个高倍视野，计算黄褐色阳性表达的面积，以此表示TLR2及NF-κBp65蛋白的表达，然后进行半定量分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 小鼠行为和体态变化

造模前，小鼠活动正常，纳香，大便正常，模型组体质量与对照组比较无统计学差异；造模前期小鼠体质量增长较快，后期逐渐变缓，甚至体质量减轻，精神正常，纳呆少饮，嗜睡，活动少，毛发松弛毛糙，阴囊松驰下垂，大便干稀不调，肛温较造模前升高，小便色黄。给药后，灭幽汤组小鼠体质量逐渐增加，皮毛逐渐顺滑，饮水、饮食量增多，活动变多。模型组小鼠仍纳差，饮水减少，嗜睡，活动少，毛发松弛毛糙，阴囊松驰下垂，大便干稀不调，肛温较造模前升高，小便色黄，说明灭幽汤组在改善小鼠摄食、大便等症状方面作用明显。

2.2 各组小鼠阴转率、组织病理学的比较

模型组小鼠血清HP抗体检测阳性，药物治疗组治疗前后胶体金法HP检测统计结果（见表1），与模型组比较，灭幽汤组、胃三联组治疗后比较，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；灭幽汤组和胃三联组治疗后比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 HP感染小鼠胶体金法HP检测结果 （只）

HP定植情况：模型组电镜下均发现有HP的定植，透射电镜下观察到小鼠胃幽门部黏膜表面HP聚集生长；甚至有些小鼠黏膜层细胞水肿，部分HP侵入到黏膜层。见图1。

各组小鼠胃组织病理改变：光镜下，正常组小鼠胃黏膜表面光滑，无明显充血水肿、糜烂，腺体排列整齐。模型组小鼠胃窦部的炎症程度重，小鼠胃黏膜充血肿胀，表面欠光整，腺体排列较紊乱，可见较多的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞浸润，炎症细胞甚至到达黏膜下层，甚至可见黏膜的出血。胃三联治疗组炎症程度明显减轻，固有层仅有水肿，少量淋巴细胞。灭幽汤组小鼠胃黏膜表面稍欠光滑，仅固有层有水肿、无糜烂，腺体排列整齐，仅有少量淋巴细胞浸润。见图2（封三彩图）。

图1 电镜下HP定值观察

2.3 各组小鼠胃黏膜NF-κBp65免疫组化结果

免疫组化图片中黄褐色区域为阳性表达。光镜下观察，空白组小鼠胃黏膜组织NF-κBp65仅有少量阳性表达；模型组有大量阳性表达；灭幽汤组和胃三联组小鼠胃黏膜组织有少量NF-κBp65阳性表达，明显少于模型组。见图3（封三彩图）。

正常组小鼠胃黏膜组织中均有少量 NF-κBp65蛋白表达。与正常组比较，模型组小鼠胃黏膜NF-κBp65蛋白表达增加，差异有显著统计学意义(P＜0.01)；与模型组比较，灭幽汤组与胃三联组小鼠胃黏膜NF-κBp65蛋白表达降低，差异有显著统计学意义(P＜0.01)；灭幽汤组与胃三联组比较，NF-κBp65表达差异无统计学意义（P＞0.05)。结果见表2。

表2 各组小鼠胃黏膜组织NF-κBP65蛋白表达的比较（±s，n=8）

表2 各组小鼠胃黏膜组织NF-κBP65蛋白表达的比较（±s，n=8）

注：与正常组比较＃P＜0.01；与模型组比较**P＜0.01。下表同。

组别正常组模型组胃三联组灭幽汤组药物剂量——279.8 mg/kg 12.4 g/kg NF-κBP65（×103μm2）189.13±66.14 1 605.90±288.04#453.89±145.32** 421.49±137.32**

2.4 各组小鼠胃黏膜TLR2免疫组化结果

免疫组化图片中黄褐色区域为阳性表达。光镜下观察，空白组小鼠胃黏膜组织TLR2几乎无阳性表达；模型组小鼠胃黏膜组织TLR2有大量阳性表达；灭幽汤组和胃三联组小鼠胃黏膜组织有少量TLR2阳性表达，明显少于模型组。见图4（封三彩图）。

正常组小鼠胃黏膜组织中仅有少量TLR2蛋白表达。与正常组比较，模型组小鼠胃黏膜TLR2蛋白表达增加，差异有显著统计学意义(P＜0.01)；与模型组比较，灭幽汤组与胃三联组小鼠胃黏膜TLR2表达降低，差异有显著统计学意义(P＜0.01)；灭幽汤组与胃三联组比较，TLR2表达差异无统计学意义（P＞0.05)。结果见表3。

表3 各组小鼠胃黏膜组织TLR2蛋白表达的比较（±s，n=8）

表3 各组小鼠胃黏膜组织TLR2蛋白表达的比较（±s，n=8）

组别正常组模型组胃三联组灭幽汤组药物剂量——279.8 mg/kg 12.4 g/kg TLR2（×103μm2）118.48±48.54 1 580.52±276.82#339.70±120.37** 327.68±76.99**

3 讨论

Toll样受体是一种定位于细胞膜的跨膜蛋白，可感知病原体的存在并启动机体防御相关基因的表达，从而发挥抵抗细菌感染的作用[13]，其中TLR2研究较多且作用相对明确。TLR2作为主要分布于单核/巨噬细胞的一种主要TLRs，能分别识别G+菌成分和G-菌成分等病原体的模式识别受体，通过在侵入部位导致该转录因子的转位与相应免疫基因的活化而转录，产生促炎细胞因子、趋化因子及其他炎症介质等起到调节炎症反应的作用[14-15]。国外学者研究表明HP感染及其菌体成分可上调TLR的表达[16]，Kawahara和Takenaka等[17-18]研究证实HP及其脂多糖和热休克蛋白60(Hsp60)通过TLR尤其是TLR2信号通路激活NF-κB和刺激白细胞介素-8（IL-8）分泌，引起炎症反应。

NF-κB是一种重要的核转录因子，是普遍存在于细胞质中的快反应转录因子，位于TLR下游信号通路的枢纽位置。在静息状态下，NF-κB大多以p65，p50蛋白二聚体与NF-κB抑制因子(IKB)偶联，以无活性的复合体形式存在于细胞质中。与IKB解离的NF-κBp65可反映NF-κB的活性。IKKβ[19]是I-κB磷酸化激酶，它诱导IκB磷酸化，使NF-κB/I-κB二聚体解离，暴露NF-κB的核定位片段是NF-κB活化和移位的前提。活化的NF-κB能与DNA特定的kB位点结合，启动和调节众多参与炎症反应、免疫反应有关基因的转录，调控肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素(IL-lβ、IL-6、IL-8)等细胞因子和细胞间黏附分子-l(VCAM-1)等黏附分子的表达，在机体的炎症、免疫反应等方面发挥重要作用。本研究组前期已证实[12]，灭幽汤可能通过影响NF-κB和IKKβ的蛋白表达达到治疗HAG的作用。

HAG归属于中医胃脘痛、痞满、嘈杂、反酸等范畴，绝大多数的研究结果显示慢性胃病脾胃湿热证的HP感染率较高[20-23]。 灭幽汤方[5-12]是王小娟教授结合多年的临床经验组方而成，以清热利湿为基本组方原则。方以黄芩、蒲公英清热燥湿解毒药为君，以除脾胃之湿热；青皮、陈皮行肝脾气滞以疏通气机；佐以三七、白及，既活血化瘀助青皮、陈皮协调气血之运行，又收敛生肌修复局部之病灶；重用乌贼骨制酸止痛而为之使。现代研究表明：黄芩、蒲公英能抗多种病原微生物，对多种球菌和杆菌有杀灭作用；乌贼骨含有丰富碳酸盐和磷酸盐能改变胃的酸性内环境，抑制HP的生长；白及祛腐生肌可修复糜烂的胃黏膜；三七活血化瘀止痛、消炎生肌，能促进血液循环消除组织水肿，促进黏膜增生，加快修复。

本实验采取复合因素（肥甘食物+湿热环境+幽门螺杆菌）建立脾胃湿热型HAG小鼠模型，模型成功评定：小鼠以胶体金法检测HP显示阳性、电镜下实验组均发现有HP的定植；小鼠一般生理表现：精神萎顿，好睡，活动少，纳呆，饮水减少，毛发松弛毛糙，阴囊松驰下垂，大便偏稀，小便色黄，体质量减轻，肛温升高；光镜下HE染色观察胃黏膜炎症程度，发现小鼠胃黏膜充血肿胀，表面欠光整，腺体排列较紊乱，可见较多的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞浸润，甚至到达黏膜底层，黏膜未见糜烂。

本研究结果显示：TLR2、NF-κBp65在模型组中表达均高于正常组，给予灭幽汤干预后TLR2、NF-κBp65明显降低，HAG小鼠胃黏膜组织炎症亦明显减少，说明根除幽门螺杆菌后能下调TLR2、抑制NF-κBp65的激活，从而阻止NF-κB的活化，进而达到抗炎作用。因而我们推测灭幽汤可能是通过选择此靶点来治疗HAG。

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（本文编辑 杨 瑛）

Effects of Mieyou Decoction on TLR2 and NF-κBp65 in Gastric Mucosa Tissues of Mice with Helicobacter pylori-related Gastritis

WANG Xiaojuan1,YIN Jiao2,GUO Jiansheng2,YU Bin2*,DU Zhonghua2,LUO Yan2,XIA Rong2
（1.The first Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007, China;2.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 401208,China）

Objective To explore effects and action mechanism of Mieyou Decoction on TLR2 and NF-κBP65 in gastric mucosa tissues of mice with Helicobacter pylori-related gastritis Methods BALB/c mice were randomly assigned to normal control group,model group,gastric triad group,Mieyou group,developed a model of HAG BALB/c mice Spleen-stomach Damp-heat Syndrome by composite factors (high sugar and fat food+hot and humid environment+H. Pylori).The immunohistochemical assay was adopted to detect the protein expressions of nuclear transcriptionfactorTLR2andNF-κBP65.ResultsComparedwithnormalcontrolgroup,theexpressions of TLR2 and NF-κBp65 in gastric mucosa of mice(model group)increased (P＜0.05),compared with model control group,the expressions decreased in Mieyou Decoction group (P＜0.05).Conclusion Mieyou Decoction can eradicate H．pylori,regulate the expressions of TLR2 and NF-κBp65 in gastric mucosa of mice,alleviate gastric mucosal inflammation.HAG was treated by Mieyou Decoction probably through down-regulating the expressions of TLR2, inhibiting the activation of NF-κBp65,thus hindering the activation of NF-κB,then producing treatment effect.

H.pylori;Gastritis;Mieyou Decoction;TLR2；NF-κBp65

R573.3；R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.07.004.018.05

2013－10－08

湖南省自然科学基金资助项目(12JJ2046)；湖南省科技厅科研资助项目(2011SK3096)；湖南省科普计划资助项目(2013KP0111)；湖南中医药大学研究生校级科研资助项目。

王小娟，女，教授，硕士研究生导师，研究方向：消化系统疾病研究。

*喻 斌，男，硕士，教授，硕士研究生导师，E-mail：272445871@qq.com。