利用Flo1p锚定蛋白在酿酒酵母表面展示三种纤维素酶的纤维素乙醇发酵

莫春玲，杨越悦，陈宁，杨秀山，田沈

首都师范大学生命科学学院，北京 100048

利用Flo1p锚定蛋白在酿酒酵母表面展示三种纤维素酶的纤维素乙醇发酵

莫春玲，杨越悦，陈宁，杨秀山，田沈

首都师范大学生命科学学院，北京 100048

莫春玲, 杨越悦, 陈宁, 等. 利用Flo1p锚定蛋白在酿酒酵母表面展示三种纤维素酶的纤维素乙醇发酵. 生物工程学报, 2014, 30(9): 1401−1413.

Mo CL, Yang YY, Chen N, et al. Display cellulolytic enzymes on Saccharomyces cerevisiae cell surface by using Flo1p as an anchor protein for cellulosic ethanol production. Chin J Biotech, 2014, 30(9): 1401−1413.

为了简化纤维素乙醇生产工艺，实现纤维素利用与乙醇发酵的同步进行，通过酵母细胞表面展示技术，以酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae Y5为受体，通过絮凝素 (Flo1p) 锚定方式，将来自丝状真菌里氏木霉Trichoderma reesei的内切葡聚糖酶Ⅱ(EGII)、纤维二糖水解酶Ⅱ(CBHII)以及来自棘孢曲霉Aspergillus aculeatus的β-葡糖苷酶Ⅰ(BGLI) 展示在细胞表面，构建同时表达3种纤维素酶的酵母菌群系统。经过免疫荧光验证展示酶的细胞蛋白定位，酶活测定，乙醇发酵性能验证，结果表明：展示表达的3种纤维素酶具有良好的稳定性和功能活性；在EGII、CBHII和BGLI协同作用下重组酵母菌株能够水解溶胀磷酸纤维素 (Phosphoric acid swollen cellulose，简称PASC) 并产生乙醇，乙醇浓度达到最大值0.77 g/L，乙醇产量为0.35 g/g，相当于理论值的68.6%。本研究成功构建了利用Flo1p作为锚定蛋白的絮凝素展示系统，初步实现了纤维素利用与乙醇发酵的同步进行，为利用酿酒酵母表面展示技术固定并表达纤维素酶提供了一定的理论依据。

细胞表面展示，Flo1锚定蛋白，酵母菌群，纤维素乙醇

以石油等不可再生资源为基础的现代工业化社会的发展模式正面临能源枯竭的严重威胁，作为一种安全的液体燃料和石油添加剂，燃料酒精是公认为最具发展前景的可再生清洁能源之一[1]。以农作物秸秆、垃圾纤维等纤维素类物质为代表的生物质物质具有来源广泛、价格低廉、可再生等诸多优点，因此研究开发木质纤维素类物质的生物转化技术对于开发新能源，保护环境具有重要的现实意义[2]。

目前，酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae是工业上生产乙醇的优良菌株。然而，在利用纤维素物质进行乙醇生产的过程中，酵母不能直接利用纤维素类物质，同时由于纤维素酶制剂的生产成本过高也制约纤维素乙醇的大规模应用。为了简化加工过程，降低能耗，酵母表面展示技术应运而生，该项技术是近年来随着基因工程的发展而兴起的可将外源蛋白锚定在细胞壁上并表达的重要生物技术，近年来颇受关注[3]，酵母表面展示系统以酿酒酵母表面展示系统发展较为完善。根据外源目的蛋白与酵母细胞壁蛋白的融合部位不同，酿酒酵母表面展示系统主要分为凝集素系统和絮凝素系统。絮凝素Flo1p是一种在絮凝中起重要作用的酵母细胞壁蛋白，由Flo1基因编码，Flo1p的功能结构域包括两部分，一部分是C-端的GPI锚定区，可以与细胞膜、细胞壁结合；另一部分是N-端的絮凝结构域，可以与胞壁糖类相结合。以絮凝素为锚定蛋白，外源靶蛋白酶分子可实现在酿酒酵母表面C-端和N端锚定两种截然不同的展示方式[4]。一些大小在0.93–136 kDa的外源蛋白已经成功地利用絮凝素展示系统固定在酵母细胞表面，如淀粉酶、脂肪酶等[5-7]。

在酵母表面展示纤维素酶的众多研究中，采用凝集素展示系统的研究居多[8-10]，而利用絮凝素展示系统的鲜有报道。絮凝素展示系统作为后续发展系统，已被证实具有更多的展示方式和更好的展示能力[11]。通过构建酿酒酵母絮凝素展示系统将纤维素酶展示在酵母细胞表面，以固定化酶的方式来实现纤维素水解和乙醇发酵同步进行，从而大大简化了乙醇生产工艺流程，降低生产成本，提高纤维素的利用效率；同时该展示系统可以依据不同的目的蛋白来选择不同的展示方式，被展示的外源蛋白能够保持相对独立的空间结构和生物活性，推动了纤维素酶固定化的进一步研究和开发。

在前期的研究中，已成功构建基于a-凝集素的S. cerevisiae Y5表面展示系统并成功使EGII、CBHII及BGLI在Y5细胞表面得以展示[12]。S. cerevisiae Y5为实验室专利授权菌株，它具有较高的乙醇产率，代谢副产物少，耐受乙醇及其他抑制剂能力强等优点。因此本研究利用S. cerevisiae Y5絮凝素为锚定蛋白构建絮凝素展示系统，将3种纤维素酶都以较优良的活性形式展示在宿主细胞表面。通过这一安全无污染、环境友好型的改造，很大程度上简化燃料乙醇的生产流程，降低能耗，同时为实现全细胞催化纤维素乙醇的生物转化提供基础，所以此系统具有较广的应用前景[13-14]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

S. cerevisiae Y5[15]作为纤维素酶展示的宿主菌；大肠杆菌Escherichia coli Top 10 (Tiangen生化) 用于亚克隆；里氏木霉Trichoderma reesei 40358和棘孢曲霉Aspergillus aculeatus 2193购自中国工业微生物菌种保藏管理中心 (CICC)，作为纤维素酶基因的来源。

酵母表面展示载体pYD1购自Invitrogen;酵母整合载体YIP5-KanR由本实验室保存。

1.1.2 培养基及培养条件

LB培养基 (g/L)：酵母粉 5，胰蛋白胨10，NaCl 10，pH 7.0，添加100 μg/mL氨苄青霉素于37 ℃，200 r/min 条件下用于E. coli 转化子的筛选。

YPD培养基 (g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20，添加600 μg/mL的G418于30 ℃，150 r/min条件下筛选酵母转化子。

YPG培养基 (g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，半乳糖20，20 ℃、120 r/min条件下用于酵母转化子的诱导。

YP-PASC培养基 (g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，磷酸膨胀纤维素[16]10，30 ℃、150 r/min条件下用于纤维素水解及乙醇发酵。

表1总结了本研究涉及的相关展示载体及重组菌株的特性。

1.1.3 工具酶和化学试剂

限制性内切酶购自TaKaRa公司；DNA连接酶购自Fermentas；Taq DNA聚合酶、DNA分子量标准、质粒提取试剂盒、琼脂凝胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；微晶纤维素Avicel PH-101及羧甲基纤维素 (CMC) 购自Sigma；其他抗生素与生化试剂均为国产或进口分析纯；引物合成和基因序列测定均由北京三博远志生物技术有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 絮凝素展示系统基因的获得及表达载体的构建

根据S. cerevisiae Y5基因组的相关基因序列设计引物，以S. cerevisiae Y5的cDNA为模板，分别扩增得到絮凝素展示系统的信号肽基因片段(MF.SS)和絮凝素C端锚定的基因片段(FLO1)。MF.SS片段经SacⅠ/NheⅠ双酶切后插入pYD1质粒的GAL1启动子下游，FLO1片段经SphⅠ/SalⅠ双酶切后插入pYD1质粒的多克隆位点的下游；根据已知的kanr基因序列设计引物，以质粒YIP5-KanR为模板扩增获得kanr.ORF片段，经SpeⅠ/SalⅠ双酶切得到kanr基因的ORF片段，插入质粒pYD1的相应位点。以上构建所得中间载体称为pFlo1。

表1 重组菌株及展示载体特征Table 1 Relevant features of recombinant strains and plasmids used in this study

根据T. reesei的EGII与CBHII基因序列和A. aculeatus的BGLI基因序列设计引物，分别以已构建好的质粒pEGII (EBNA)、pCBHII (EBNA)、pBGLI (NB)为模板，通过PCR的方法扩增获得egl2与cbh2及bgl1去除本身信号肽的成熟区域。将由KpnⅠ/BamHⅠ双酶切得到的egl2片段插入到pYD1的相应位点之间，获得的最终表达载体命名为pEGII (KB)；将由KpnⅠ/BamHⅠ双酶切的cbh2片段替换掉pEGII (KB)的egl2得到表达载体pCBHII (KB)；将NotⅠ/SphⅠ双酶切得到的bgl1片段插入到pYD1的相应位点之间，获得表达载体pBGLI (NS)。筛选获得重组质粒阳性克隆，并进行测序和鉴定。

本研究中使用的引物序列及对应酶切位点见表2。

1.2.2 酵母转化及筛选

将测序结果正确的表面展示载体pEGII(KB)、pCBHII(KB)、pBGLI(NS)利用LiAc完整细胞法[17]分别转化Y5，转化后在含不同浓度G418 (500 μg/mL、600 μg/mL和700 μg/mL)的YPD平板上筛选得到转化子。挑取单克隆进行细胞的扩大培养，分别提取酵母质粒作为模板，进行PCR验证，PCR产物经测序正确后，将阳性转化子分别命名为Y5/fEGII、Y5/fCBHII和Y5/fBGLI。

1.2.3 表面展示蛋白的定位验证

参照文献[18]进行：取经半乳糖诱导48 h的重组酵母菌株Y5/fEGII、Y5/fCBHII和Y5/fBGLI，以Y5为阴性对照，进行免疫荧光检测。样品经1×PBS溶液洗涤后，取沉淀悬浮于250 μL的1×PBS、1 mg/mL BSA中，抗Xpress标签的小鼠单克隆抗体 (Invitrogen anti-Xpress mouse monoclonal IgG 按体积比1∶1 000稀释加入)，室温放置1.5 h，每隔15 min轻微振荡1次。1×PBS离心洗涤若干次后，加入1×PBS、1 mg/mL BSA和异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗鼠源的二抗 (Jackson, FITC-conjugated goat anti-mouse IgG(H+L)，按体积比1∶200稀释加入)，在黑暗处放置1 h。离心，1×PBS洗涤2次后，在免疫荧光显微镜下观察。

表2 引物序列及相应酶切位点Table 2 Primer sequences and restriction sites used in this study

1.2.4 重组菌株酶活测定

菌株Y5/fEGII、Y5/fCBHII和Y5/fBGLI经预培养后在YPG中诱导48 h，将1 mL菌液离心后取细胞沉淀用于酶活测定。酶活性测定采用DNS显色法与pNPG显色法[19]。

EGII活性测定方法如下：以2 mL 1% (W/V)的CMC (50 mmol/L柠檬酸缓冲液 (pH 5.0) 配制) 为底物，50 ℃保温3 min后，加入0.5 mL适当稀释的酶液50 ℃反应30 min，再加入2.5 mL DNS沸水浴5 min，最后加蒸馏水定容至10 mL，在540 nm处测吸光值。对于CBHII活性测定，是以 2 mL 0.4% (W/V)的 PASC (50 mmol/L醋酸钠缓冲液 (pH 5.0) 配制) 为底物，其他条件同EGII活性测定过程。一个EGII/CBHII活性单位定义为：每分钟水解底物产生1 μmol/L 还原糖所需要的酶量[16]。

BGLI活性的测定方法如下：1 mL适当稀释的酶液与1 mL 1.7 mmol/L的对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)溶液 (0.1 mmol/L醋酸钠溶液配制，pH 5.0) 混合后，于37 ℃下保温10 min后，立即加入2 mL 1 mol/L Na2CO3，添加蒸馏水定容至10 mL，摇匀，在400 nm下测定吸光度。一个BGLI活力单位定义为：每分钟水解生成1 μmol/L对硝基苯酚所需要的酶量[20]。

1.2.5 单展示菌群的纤维素乙醇发酵

重组菌株经预培养，诱导48 h后，将菌株Y5/fEGII、Y5/fCBHII和Y5/fBGLI按1∶1∶1混合为单展示酵母菌群，重悬于100 mL YP-PASC培养基中，总的酵母菌群细胞量为30 g/L湿重，于30 ℃、150 r/min条件下进行纤维素乙醇发酵。发酵起初每隔4 h取样1次，12 h后每隔12 h取样1次，连续取样108 h。测定发酵样品总糖、葡萄糖和乙醇浓度。总糖测定采用苯酚-硫酸法[18]；葡萄糖浓度以高效液相色谱(HPLC, 安捷伦1260) 测定，条件：H(Hi-Plex H)柱 (300 mm×7.7 mm)，柱60 ℃，示差检测器RID，检测器温度40 ℃，流动相稀硫酸 (0.005 mol/L)，流速0.6 mL/min，进样量5 μL。乙醇浓度以气相色谱 (GC，安捷伦7890A GC；HS，model Agilent 7694E) 测定，条件：色谱柱为HJ-PEG-20M，柱温120 ℃，检测器温度200 ℃，N2为载气，流速4 mL/min，样品离心后过滤除菌 (滤头规格13 mm、0.22 μm)，自动进样1 μL。

2 结果与分析

2.1 絮凝素系统所需基因的获得

以S. cerevisiae Y5的cDNA为模板，利用设计的引物扩增MF.SS和FLO1基因 (含MAT终止子) 的有效编码序列，大小分别为282 bp和1 351 bp。PCR产物经电泳验证，分别在282 bp与1 351 bp处显示清晰明亮条带 (图1A, B)；根据质粒YIP5-KanR的序列特点，kanr两端的启动子和终止子序列互补性较高，较难一步扩增得到kanr的全长序列，设计引物时人工去除kanr基因的终止子部分，只扩增该基因的ORF片段，大小为1 293 bp，kanr.ORF的PCR产物经电泳验证，在1 293 bp处显示正确条带(图2C)；分别以T. reesei及A. aculeatus的cDNA为模板扩增到EGII、CBHII与BGLI去除信号肽的编码序列，大小分别为1 194 bp、1 341 bp和2 526 bp (图1D, E, F)，经电泳验证，PCR产物均在相应位置显示正确条带。以上基因的测序结果表明，与NCBI公布的序列同源性均达到100%。

2.2 表面展示载体的构建

表达载体pEGII (KB)、pCBHII (KB)和pBGLI (NS) 的构建流程见图2。

图1 本研究所需的DNA片段Fig. 1 DNA fragments used in this study. Gene encoding for MF.SS (A), FLO1 (B), open reading frame of kanr (C), egl2 (D), cbh2 (E), bgl1 (F).

图2 展示载体构建示意图Fig. 2 Plasmids for cell surface display.

将经KpnⅠ/BamHⅠ双酶切的egl2片段与cbh2片段分别插入到酵母展示中间载体pFLO1相应位点，获得载体pEGII (KB)与pCBHII (KB)；再利用NotⅠ/SphⅠ双酶切得到bgl1片段，该片段插入中间载体pFLO1相应位点获得载体pBGLI (NS)。以KpnⅠ单酶切验证，pEGII (KB)与pCBHII (KB)大小分别为8 776 bp和8 923 bp，以NotⅠ单酶切验证，pBGLI (NS)的大小为10 109 bp，以上单酶切结果均与理论值相符 (图3A)；再以KpnⅠ/BamHⅠ双酶切验证，分别切下大小为7 937 bp的pFLO1片段和1 194 bp的egl2片段与1 341 bp的cbh2片段，以NotⅠ/SphⅠ双酶切验证，分别切下大小为7 937 bp的pFLO1片段和2 526 bp的bgl1，以上双酶切结果均符合理论值 (图3B)。测序结果表明所有插入片段在表达载体中均有正确的阅读框。

图3 重组质粒的酶切鉴定Fig. 3 Recombinant plasmids digested with restriction enzyme. (A) KpnⅠ, NotⅠ. (B) KpnⅠ/BamHⅠ, NotⅠ/SphⅠ.

2.3 酵母转化及转化子验证

表达载体pEGII (KB)、pCBHII (KB)与pBGLI (NS)通过LiAc完整细胞转化法转化到S. cerevisiae Y5中，涂布于含G418的YPD固体培养基上得到转化子。随机挑取筛选得到的转化子单菌落预培养24 h后依次进行质粒提取，分别以质粒作为模板进行PCR，通过琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物的正确性。结果如图4所示，重组菌株Y5/fEGII的质粒扩增出大小为1 194 bp的特异性条带；菌株Y5/fCBHII的质粒扩增出大小为1 341 bp的特异性条带；菌株Y5/fBGLI的质粒扩增出大小为2 526 bp的特异性条带。三株重组菌株均扩增得到目的基因片段egl2、cbh2、bgl1。测序结果表明，三段PCR产物的序列正确性均达100%，表明纤维素酶表达载体已成功导入到酵母中。

2.4 表面展示蛋白定位验证

挑取经鉴定正确的重组菌株Y5/fEGII、Y5/fCBHII、Y5/fBGLI和对照菌株Y5分别接种至中预培养24 h，收集菌体后，转接YPG培养基进行诱导表达。重组菌株诱导表达48 h后，采用免疫荧光显微镜 (FITC，激发波长488 nm)观察表面展示重组酵母菌株在半乳糖的诱导下是否能够表达纤维素酶与Xpress标签形成融合蛋白展示在细胞表面。由图5观察结果显示，在488 nm通道下，表面展示重组酵母菌株Y5/fEGII、Y5/fCBHII和Y5/fBGLI在诱导表达48 h后均可以检测到绿色免疫荧光，野生菌株Y5没有观察到荧光。该结果表明来自酿酒酵母Y5的GPI蛋白可作为表面展示的锚定蛋白，带有Xpress标签的外源蛋白EGII、CBHII及BGLI均已经成功被锚定在细胞壁上。尽管重组菌株的表面展示蛋白分布是不均匀的，这可能是由于蛋白的表达水平不同造成的。

2.5 表面展示纤维素酶的酶活分析

图4 重组菌株的质粒PCR鉴定Fig. 4 Identification of recombinant strains by plasmid PCR.

图5 重组菌株Y5/fEG II、Y5/CBH II和Y5/BGLI免疫荧光验证 (100×)Fig. 5 Immunofluorescence labeling of transformants ZEISS Laser Scan Confocal micrographs (column 1) and immunofluorescence micrograph (column 2) of S. cerevisiae Y5/FEG II, Y5/fCBH II and Y5/fBGL I (100×).

表3 展示在Y5细胞表面的纤维素酶活性测定Table 3 Activity of enzymes displayed on cell surface of Y5 strain

对照菌株Y5与单展示纤维素酶的3株重组菌Y5/fEGII、Y5/fCBHII和Y5/fBGLI经预培养24 h后接种于YPG培养基诱导48 h。Y5为对照组，3株重组菌为实验组。经诱导后，取一定量菌液进行酶活测定。测定结果如表3所示，对照菌株Y5酶活性不足0.1 U/mL；实验组菌株均表现出一定酶活性，证明纤维素酶成功展示在Y5表面。EGII和CBHII活性较高，分别为1.401 U/mL和1.845 U/mL，絮凝素表面展示系统中这两种纤维素酶的活性均比本实验室已构建的凝集素表面展示系统的重组菌株Y5/EGII的EGII酶活 (1.144 U/mL) 和Y5/CBHII的CBHII酶活 (1.265 U/mL) 稍高，菌株Y5/fBGLI的活性较低，为0.81 U/mL，与凝集素表面展示系统的重组菌株Y5/BGLI的BGLI酶活0.722 U/mL相近[15]。分析原因是絮凝素表面展示系统可根据酶活性末端来调节锚定区域以发挥展示酶类的最优活性，所以纤维素酶在絮凝素展示系统中较凝集素展示系统稍高。这些结果表明絮凝素展示系统中的纤维素酶EGII、CBHI和BGLI都已成功展示酿酒酵母Y5表面，并且具有一定的功能活性。

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2.6 重组酵母菌群的纤维素乙醇发酵

以10 g/L PASC为唯一碳源，对照菌群Y5为对照组，混合菌群 (Y5/fEGII、Y5/fCBHII和Y5/fBGLI按1∶1∶1组合) 为实验组进行纤维素乙醇发酵实验。菌株经预培养24 h后接种于100 mL的YP-PASC发酵培养基中30 ℃连续发酵108 h。结果如图6所示，对照组不能降解PASC，体系中的总糖基本不消耗，没有乙醇的产生；实验组能水解PASC并产生一定量的乙醇，前48 h菌群生长较快 (数据未展示)，体系中的总糖消耗迅速，乙醇产量快速上升，48 h后菌群生长速度减慢，总糖消耗速度下降，乙醇产量积累也减缓，在发酵96 h后达到最高乙醇浓度0.77 g/L，以消耗每克糖生成的乙醇量计算，产量为0.35 g/g，相当于理论值的68.6%。尽管最终的乙醇产量并不理想，最高仅达到了理论值的68.6%，与本实验室已构建的凝集素系统的单展示混合菌群 (Y5/EGII、Y5/CBHII和Y5/BGLI按1∶1∶1组合) 的乙醇产量0.32 g/g，相当于理论值的62.6%这个结果相比，基于絮凝素系统的纤维素乙醇发酵的产量有所上升，取得了一定的进步。

图6 不同酵母菌群以PASC为唯一碳源的乙醇发酵Fig. 6 Ethanol production from PASC by different yeast consortium. The concentrations of total sugar (A) and ethanol (B). Data are averages from three independent experiments.

3 讨论

本研究基于酿酒酵母絮凝素表面展示系统，利用S. cerevisiae Y5内源蛋白Flo1p作为锚定蛋白，将外源纤维素酶EGII、CBHII和BGLI以较优的活性形式分别固定在S. cerevisiae Y5细胞表面，并以PASC为唯一碳源进行了纤维素乙醇生物统合加工的初步研究。研究结果显示，基于Y5的重组菌株均具有相应的纤维素催化活性，酶活测定结果与本实验室前期a-凝集素表面展示纤维素酶活性相比，有了较为明显的提升。分析原因，Y5本身具有自絮凝的工业化生产特性，使得细胞之间接触紧密，空间位阻较大，一定程度上阻碍了纤维素酶与底物的接触吸附[22]，而新型的絮凝素表面展示系统利用Flo1p进行纤维素酶的锚定，一定程度上减轻了酵母的自絮凝现象，增大了细胞间隙，从而增加了酶与底物的接触面积，提高了酶的催化效率。此外，发酵结果显示，絮凝素系统的重组酵母菌株Y5/fEGII、Y5/fCBHII和Y5/fBGLI以1∶1∶1的比例组成菌群后，对PASC具有明显的降解利用能力，反应体系中未检测出葡萄糖积累，说明降解得到的葡萄糖迅速被酵母吸收利用产生乙醇，最高乙醇浓度达到0.77 g/L，乙醇产量为0.35 g/g，相当于最高理论值的68.6%，与本实验室前期构建的a-凝集素表面展示纤维素酶菌群最优发酵结果 (菌群比例2∶1∶1，最高乙醇浓度达到0.76 g/L，乙醇产量为0.33 g/g，相当于理论值的64.9%) 相比，絮凝素表面展示系统体现出了一定的优势。这是本实验室首次尝试基于专利菌株Y5构建絮凝素表面展示系统进行纤维素水解与乙醇发酵生物联合加工研究，以上结果说明，利用絮凝素展示系统表达外源纤维素酶进行纤维素乙醇发酵具有一定的发展前景，为开发生物统和加工 (Consolidated bioprocess，CBP) 菌种提供了理论依据，具有一定的应用价值。此外，本研究构建的酵母菌群系统通过调节菌群中不同组分的比例对纤维素水解及乙醇产量的影响来探究不同纤维素酶间的协同作用，该菌群系统可作为研究纤维素酶降解效率的有效工具。

即使如此，利用酵母表面展示技术表达纤维素酶的新型酵母菌群进行纤维素乙醇发酵效果还不是很理想，乙醇产率较低，难以满足实际生产需求，因此在今后的工作中，我们主要在以下两个方面进行改进：1) 开发基于N-端锚定的表面展示工作[23]，完善酿酒酵母絮凝素表面展示系统，实现针对不同外源酶类灵活选择锚定方式的目标，尽可能降低对酶类的束缚，实现酶催化效率的最大化；2) 调控3种酵母菌群间的比例，从而实现对3种协同作用纤维素酶之间比例的调控，摸索出最优模式，利用优化的菌群进行纤维素乙醇统合生物加工，提高底物利用率，提升乙醇产量[24]。

利用酿酒酵母表面技术展示纤维素酶实现同步发酵纤维素产乙醇的研究已取得一定的研究成果，但是在这一领域里仍存在一些亟待解决的问题，例如：展示在细胞表面的纤维素酶的活性与游离酶相比有所下降；成功展示的纤维素酶稳定性有待提高；对于该技术的研究目前仍停留在实验室阶段，还未实现工业化等[25-26]。今后此领域的研究还需更多的发展和完善，包括开发更多具有固定化展示功能的细胞壁甘露糖蛋白；进一步提高现有展示的纤维素酶的稳定性、表达量及活性；克服工业化生产中扩大培养、乙醇抑制等难题。

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(本文责编 郝丽芳)

Display cellulolytic enzymes on Saccharomyces cerevisiae cell surface by using Flo1p as an anchor protein for cellulosic ethanol production

Chunling Mo, Yueyue Yang, Ning Chen, Xiushan Yang, and Shen Tian
College of Life Science, Capital Normal University, Beijing 100048, China

In this study, we constructed a yeast consortium surface-display expression system by using Flo1 as an anchor protein. Endoglucanase II (EGII) and cellobiohydrolase II (CBHII) from Trichoderma reesei, and β-glucosidase 1 (BGLI) from Aspergillus aculeatus were immobilized on Saccharomyces cerevisiae Y5. We constructed the cellulose-displaying expression yeast consortium (Y5/fEGII:Y5/fCBHII:Y5/fBGLI=1:1:1) and investigated the enzymatic ability and ethanol fermentation. The displayed cellulolytic enzymes was stabile during the 96-h fermentation. The yeast consortium produced 0.77 g/L ethanol from 10 g/L phosphoric acid swollen cellulose (PASC) within 96 h. The yield (in grams of ethanol produced per gram of carbohydrate consumed) was 0.35 g/g, which correspond to 68.6% of the theoretical yield.

cell surface display, Flo1 protein, yeast consortium, cellulosic ethanol

December 3, 2013; Accepted: January 7, 2014

Shen Tian. Tel: +86-10-68902330; E-mail: cnu_tianshen@sina.com

Supported by: National Science and Technology Support Plan (No. 2013BAD22B03), National Natural Science Foundation of China (No. 31100578), Key Project of Beijing Scientific Research Plan (No. KZ201310028034).

国家科技支撑计划(No. 2013BAD22B03)，国家自然科学基金(No. 31100578)，北京市教育委员会科技计划重点项目(No. KZ201310028034) 资助。

Received: December 3, 2013; Accepted: January 7, 2014

Supported by: National Science and Technology Support Plan (No. 2013BAD22B03), National Natural Science Foundation of China (No. 31100578), Key Project of Beijing Scientific Research Plan (No. KZ201310028034).

Corresponding author: Shen Tian. Tel: +86-10-68902330; E-mail: cnu_tianshen@sina.com

国家科技支撑计划(No. 2013BAD22B03)，国家自然科学基金(No. 31100578)，北京市教育委员会科技计划重点项目(No. KZ201310028034) 资助。

Received: December 3, 2013; Accepted: January 7, 2014

Supported by: National Science and Technology Support Plan (No. 2013BAD22B03), National Natural Science Foundation of China (No. 31100578), Key Project of Beijing Scientific Research Plan (No. KZ201310028034).

Corresponding author: Shen Tian. Tel: +86-10-68902330; E-mail: cnu_tianshen@sina.com

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