ABCG2基因表达在Saos-2、Saos-2/MTX4.4细胞株的研究

王建军,卢 红,程传耀

(河南大学淮河医院肿瘤科,河南开封475001)

ABCG2基因表达在Saos-2、Saos-2/MTX4.4细胞株的研究

王建军,卢 红,程传耀

(河南大学淮河医院肿瘤科,河南开封475001)

目的 探索ABCG2基因在原代骨肉瘤细胞株与耐甲氨蝶呤细胞株的表达差别。方法 用免疫组化方法在原代细胞株和耐甲氨蝶呤细胞株ABCG2基因表达差别;用半定量RT-PCR方法测定ABCG2基因m RNA表达差别;结果 用免疫组化方法在原代细胞株和耐甲氨蝶呤细胞株ABCG2基因表达:耐药细胞株表达较原代增加,有明显差异(P＜0.05)。用半定量RT-PCR方法测定ABCG2基因mRNA表达:耐药细胞株ABCG2基因表达明显增加,与原代相比有明显差异(P＜0.05)。结论 耐药细胞株在ABCG2基因表达增加,免疫组化表现也明显增加,可能与耐药原因有关。

ABCG 2基因;骨肉瘤;耐药

ABCG2蛋白(ATP-binding cassette super familyG member2)是ABC(ATP-binding cassette)超家族成员之一,是一种P-糖蛋白。随着肿瘤研究的逐渐深入,肿瘤干细胞学说日益被接受和重视 ,学说认为干细胞与肿瘤的发生、转移、治疗预后密切相关。研究发现多种干细胞表达ABCG2,这很可能与保护其免遭外源及内源毒素的侵害以维持干细胞的稳定性有关;ABCG2的表达与肿瘤多药特性有关。我们实验用渐进提高MTX药物浓度方法,诱导成功的耐药细胞株,经过耐药实验发现,耐药细胞株不但对要到药物MTX存在耐药,也存在多药耐药现象。我们实验希望通过检测骨肉瘤原代细胞株与耐药细胞株ABCG2差别,探寻耐药原因。

1 材料和方法

1.1 骨肉瘤原代细胞株细胞株

Saos-2(ATCC,Manassas,VA),购自中国科学院上海细胞所。Saos-2/MTX4.4由上海交通大学肿瘤科实验室诱导成功。Saos-2为原代细胞株、Saos-2/MTX4.4为耐药细胞株,细胞处理见常规方法。

1.2 免疫组化方法测定耐药与原代细胞株在ABCG2表达情况

常规方法制作原代细胞株与耐药细胞株细胞爬片。每组做3个平行组,用不加一抗细胞爬片做阴性对照,用分别阳性组织切片做阳性对照。ABCG2一抗(sino,Bidogical Inc),免疫组化用链菌素-亲生物素过氧化物酶法(S-P)方法,操作按试剂盒要求进行,试剂盒来自于福州迈新公司。

1.3 半定量

RT-PCR方法测定Saos-2、Saos-2/MTX4.4细胞株ABCG2基因的mRNA表达。

1.3.1 细胞系RNA的提取 ①取对数生长期的Saos-2、Saos-2/MTX2.2、Saos-2/MTX4.4细胞,经胰酶消化,离心去上清,重悬,取5×106个/m L细胞悬液1 m L。②加入1 m L TRIZOL试剂裂解细胞,用枪吹打,确保细胞全部裂解,收集入1.5 m L Eppenddorf管中。③加入0.2 m L氯仿,振荡15 s,静置2 min。4℃离心,12 000转15 min,取上清。④加入0.5 m L异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置10 min。⑤4℃离心,12 000转10 min,弃上清。⑥加入1 m L体积分数75%乙醇,轻轻洗涤沉淀。4℃,7 500转5 min,弃上清。⑦室温凉干,加入适量DEPC水溶解。

1.3.2 逆转录反应cDNA的合成 ①在0.5 m L Eppendorf管中,加入总RNA1-5μg,补充适量的DEPC水使总体积达到11μL。在管中加10μmol/L Oligo(d T)1μL,轻轻混匀,离心;②70℃加热10 min,立即将微量离心管插入冰浴中至少1 min。然后加入下列试剂的混合物:10×PCR buffer 2μL; 25 mmol/L Mgcl22μL;10mmol/L d NTPmix 1μL; 0.1mol/L DTT 2μL;③轻轻混匀,离心,42℃孵育2～5 min。④加入逆转录酶(AMV)1μL,在42℃水浴中孵育50 min,于70℃加热15 min以终止反应;⑤将管插入冰浴,加入Rnase 1μL,37℃孵育20 min,降解残留的RNA。-20℃保存备用。

1.3.3 PCR反应扩增目的基因片段 ①取0.5 m L Eppendorf管,依次加入下列试剂:RNase水 12.5μL;10×PCR缓冲液5μL;d NTPmix (2 mmol/L)2μL;Mgcl22μL;上游引物(10 umol/L)0.5μL;下游引物(10 umol/L)0.5μL; Taq酶(5 U/μL)0.5μL;模板c DNA 2μL。②扩增条件为:95℃5 min;95℃30 s;56℃30 s;72℃45 s 32个循环后72℃延伸6 min,4℃保存。β-actin基因扩增条件与以上相同。③扩增产物电泳:分别取以上扩增产物各5μL经2.0%琼脂糖凝胶电泳,在Bio-Rad凝胶成像仪上观察并保存结果,分析密度。将目的基因的扩增片段密度与背景对照比值,作为其m RNA表达水平的半定量指标。RFC基因和内参照β-actin基因引物序列:RFC基因F:5’-CTGGACTTCCTCTCATGATG-3;R:5’-CTAATTGCTGCCAAGACCTC-3大小203bp;β-actin基因F:5’-ACACTGTGCCCATCTACGACC-3,R:5’AGGGGCCGGACTCGTCATAGA-3’。

1.3.4 电泳及结果分析 PCR结束后,分别取上述实验扩增产物各5μL经1.5%琼脂糖凝胶电泳,在Bio-Rad凝胶成像仪上观察并保存结果,将条带影像结果输入Image Master VDS Software 2.0图像采集及分析系统软件包进行分析,测定目的基因RFC扩增产物和与之配对的内参照β-actin扩增产物条带的密度值。结果以目的基因RFC扩增条带的密度值与内参照β-actin扩增条带的密度值的比值作为RFC基因m RNA表达的相对值。以上实验重复3次,取每次结果的平均值做统计学分析。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 用常规免疫组化方法对原代细胞株与耐药细胞株在ABCG2检测

ABCG2抗原表达在细胞包膜、胞浆;用评分法对显微镜下视野细胞分别按染色程度:0分为阴性着色;1分为谈黄色着色;2分为黄色着色;3分为浅褐色;4分为深褐色评分。并按阳性范围进行评分:1分为0～25%;2分为26～50%;3分51～75%;4分为76～100%;最终分数相加,选3张实验玻片,随机选择10个视野,用两个病理科专家分别评估,用t检验评估原代与耐药细胞株表达差别(见图1)。结果显示在ABCG2抗原表达存在差别(P＜0.05)。

图1 左侧ABCG2免疫组化Saos-2/MTX4.4细胞株爬片检测图(×100倍)右侧图ABCG2免疫组化Saos-2细胞株爬片检测图(×100倍)

2.2 Saos-2、Saos-2/MTX4.4细胞系ABCG2基因的mRNA检测结果

Saos-2细胞系ABCG2基因m RNA表达明显高于Saos-2、Saos-2/MTX4.4细胞系RFC基因m RNA表达。同时内参基因(β-actin)的基因m RNA表达。用Image Master VDS Software 2.0图像采集及分析系统软件包进行分析对比Saos-2/MTX4.4 and Saos-2与β-actin的辉度比值结果(见表1)。

表1 Saos-2、Saos-2/MTX4.4细胞ABCG2基因的m RNA表达的相对值

3 讨论

肿瘤细胞获得耐药性的机制主要有以下几种,包括突变、高表达药物靶蛋白、使药物失活或将药物从细胞中排出。在临床上化疗后复发的肿瘤可以产生多药耐药,传统的观点认为肿瘤耐药是因为肿瘤中的某些细胞发生了基因突变而导致的。这些具有选择优势的细胞可以耐受化疗而存活下来,然后增殖形成复发肿瘤[1-3]。ABCG2蛋白[ATP-binding cassette super family G member2]是ABC(ATP-binding cassette)超家族成员之一,是一种P-糖蛋白。在低氧情况下,通过比较ABCG2+/+和ABCG2-/-干(祖)细胞发现,ABCG2表达明显升高,可通过减少比咯紫质(porphyrin)的大量聚集以维持低氧条件下干(祖)细胞的稳定。细胞表达ABCG2有利于其抵抗低氧环境的侵害。而小鼠体内的干细胞也高表达ABCG2,用于防止受到细胞外有毒物质的侵害,有助于维持干细胞自身的稳定[4-5]。近来被发现在白血病、生殖系统肿瘤、乳腺癌、前列腺癌和肺癌等多种肿瘤中呈阳性表达[6-8]。我们实验耐药细胞株ABCG2+在免疫组化中强表达,原代细胞中表达阴性。Saos-2、Saos-2/MTX4.4细胞系ABCG2基因的m RNA检测结果提示:原代细胞与耐药细胞表达有明显差别。可以从一个方面解释耐药原因。

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[责任编辑 李武营]

The expression of ABCG2 gene in the study of Saos-2，Saos-2/MTX4.4 cell lines

WANG Jianjun，LU Hong，CHENG Chuanyao
（Department of Oncology，Huaihe Hospital of Henan University，Kaifeng，Henan 475001，China）

Objective To explore the difference of ABCG2 gene in primary osteosarcoma cell lines and methotrexate resistant cell line expressing.Methods The immunohistochemical method in primary cell lines and ABCG2 resistance gene of methotrexate cell lines expressing ABCG2 gene expression difference.Determination of m RNA by semi quantitative RT-PCR method.Results Immunohistochemical method in primary cell lines and ABCG2 resistance gene expression：expression of methotrexate cell lines than the primary increase the resistant cell lines，there are significant differences（P＜0.05）.To determine the expression of ABCG2 gene mRNA by semi quantitative RT-PCR method，multidrug resistance cell line ABCG2 gene expression was significantly increased，with significant difference compared with the original generation（P＜0.05）.Conclusion The expression of ABCG2 gene increased in resistant cells，immunohistochemical expression also increased，may be associated with drug resistance.

ABCG2 gene；osteosarcoma；resistant

R730.53

A

1672-7606(2014)03-0153-03

2014-05-21

王建军(1967-)男,河南开封人,副教授,副主任医师,从事临床肿瘤疾病的诊治与研究工作。