蜗牛多肽提取物对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞脑源性神经营养因子表达的影响

席守民 万学东 李三强 杨五彪 胡 澍 魏砚秋

(河南科技大学医学院药理学与医学分子生物学重点实验室，河南 洛阳 471003)

氧自由基对脑神经细胞的氧化修饰作用是导致神经元损伤的主要途径之一，在帕金森病和阿尔茨海默病的发生发展过程中具有重要的地位〔1〕。H2O2是活性氧族的主要成分之一，可以跨膜扩散进入细胞内，是一种比较常用的细胞氧化应激诱导剂，广泛用于诱导细胞氧化应激模型。Smith等〔2〕发现急慢性应激使大鼠海马等脑区细胞脑源性神经营养因子(BDNF)表达降低和神经元受损，提出神经营养和神经可塑性受损学说。研究发现，许多传统中药对脑缺血保护作用的机制是通过提高内源性BDNF的产生实现的〔3〕。蜗牛多肽提取物(SPE)对脑神经元保护作用的研究未见相关报道，本研究采用H2O2造成人神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)细胞损伤模型，观察不同浓度SPE抑制SH-SY5Y细胞氧化损伤的效果，探讨SPE对神经元细胞保护的作用机制。

1 材料与方法

1.1药物与试剂 白玉蜗牛(洛阳绿尔农业科技有限公司)；小牛血清、DMEM(Gibco BRL公司)；兔抗人单抗BDNF(武汉博士德生物工程有限公司)；SP免疫组化试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)；DAB显色试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)。

1.2蜗牛多肽提取物的制备 参照文献〔4〕中的方法，取200 g新鲜蜗牛组织加500 ml预冷冰醋酸溶液(pH3.5)，胶体磨反复匀浆，匀浆液4℃，5 500 r/min离心10 min，取上清，55℃真空旋转蒸发浓缩至体积为100 ml；浓缩液冻干，交联葡聚糖凝胶G-25分离层析，得到4个峰，分别收集，MTT法体外活性实验检测第2峰值活性最强。收集第2峰样品，浓缩冻干，BCA法测定样品中蛋白质含量为84.81%，氧化酶法测定样品中葡萄糖含量仅为0.24%，即为蜗牛多肽提取物，-20℃保存备用。

1.3细胞培养 人神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)(中国科学院上海细胞生物学研究所)用含2 mmol/L谷氨酰胺和10%小牛血清的DMEM培养基，37℃ 5% CO2培养箱中培养。隔天传代细胞，当传代细胞在倒置显微镜下观察均匀贴壁生长时，可用于实验。

1.4MTT法检测H2O2对SH-SY5Y细胞的损伤作用 将生长状态良好的SH-SY5Y细胞以1×104细胞/孔接种于96孔板，待细胞贴壁，弃去培养液，每孔加含不同浓度0.25～6.0 mmol/L H2O2的培养液200 μl，阴性对照组加不含H2O2的培养液200 μl，继续培养24 h后每孔加入5 g/L MTT溶液20 μl，继续培养4 h后弃培养液，每孔加入200 μl二甲基亚砜(DMSO)，震荡5 min后酶标仪(ELX800，美国Bio-Tek公司)检测490 nm处每孔的吸光度(A)值。细胞存活率=给药组A值/阴性对照组A值×100%。Origin软件计算半数抑制浓度IC50。

1.5MTT法测定SPE对H2O2诱导SH-SY5Y细胞损伤的抑制作用 取对数生长期的SH-SY5Y细胞，以1×104细胞/孔接种于96孔板，待细胞贴壁，H2O2组以1.54 mmol/L(IC50值)H2O2作用于SH-SY5Y细胞，SPE组分别以39、78、156、312.5、625及1 250 mg·L-1SPE和1.54 mmol/LH2O2(分别为B、C、D、E、F、G组)作用于SH-SY5Y细胞，正常对照组只有SH-SY5Y细胞，不加任何药物(A组)。给药24 h后每孔加5g/L的MTT溶液20 μl，继续培养4 h后弃培养液，每孔加200 μl DMSO，震荡5 min后酶标仪490 nm处检测吸光度值(A)。

1.6细胞免疫化学技术检测细胞BDNF的表达 取对数生长期SH-SY5Y细胞消化制备细胞悬液，调整细胞浓度为1×104/ml，接种于6孔板内，培养24 h后，将细胞分为4组，H2O2组：加1.54 mmol/L H2O2；正常对照组：正常细胞培养，不加药物；SPE-L组：加SPE 39 mg/L和1.54 mmol/L H2O2；SPE-H组：加SPE 156 mg/L和1.54 mmol/L H2O2。以上各组平行3孔，继续培养48 h后，爬片用PBS液漂洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS液洗涤后自然风干。检测方法按免疫组化试剂盒说明进行。

1.7Western 印迹检测细胞BDNF的表达 取对数生长期SH-SY5Y细胞，接种于6孔板内，培养24 h后，将细胞分为4组(分组同1.6)，继续培养48 h后，每孔分别加入120 μl 蛋白裂解液，冰浴下静置30 min，分别收集，95℃加热5 min后，取25 μl样品进行10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后取出凝胶，于4℃下60 mA电流转印过夜至硝酸纤维素膜，脱脂奶粉封闭1 h，分别加入1∶1 000稀释的BDNF单抗4℃过夜，洗膜后用1∶2 000稀释的二抗孵育2 h，按照Super Signal west pico chemiluminescent substrate 试剂盒(PIERCE公司，美国)说明，加入显色剂后，X光片于室温下自显影20 s，使用凝胶成像分析系统(GDS-800，美国UVP公司)摄像并分析。

2 结 果

2.1H2O2对SH-SY5Y细胞生长率的影响 用0.25～6.0 mmol/L不同浓度的H2O2分别处理SH-SY5Y细胞24 h后，该细胞的存活率呈浓度依赖性降低。Origin软件计算可知，H2O2对SH-SY5Y细胞IC50值为1.54 mmol/L，见图1。

2.2MTT法测定SPE抗H2O2诱导SH-SY5Y细胞毒性 加入1.54 mmol/L H2O2(A组)作用24 h后，SH-SY5Y细胞存活率仅为(47.65±3.52)%，而同时加入不同浓度的SPE的治疗组的细胞生长力明显较A组好。B〔(84.42±4.22)%〕和C组〔(92.19±7.86)%〕与A组比较差异有显著性意义(P<0.05)，D、E、F、G组〔(115.6±6.79)%、(110.18±3.99)%、(108.63±1.64)%、(113.96±0.84)%〕分别与A组比较差异有显著性意义(P<0.01)，但B组与C组比较及D～G组之间比较均无明显差异性。提示低剂量39 mg/L和高剂量156 mg/L SPE均可显著降低H2O2引起SH-SY5Y细胞毒性。

图1 MTT法检测不同浓度的H2O2处理后的SH-SY5Y细胞生长率

2.3免疫细胞化学检测SH-SY5Y细胞BDNF的表达结果 BDNF表达于细胞胞质中，染色阳性信号呈棕黄色。与正常对照组比较，H2O2组SH-SY5Y细胞BDNF的表达明显减少； SPE-L组和SPE-H组BDNF表达则较H2O2组明显增强，呈强阳性染色，且阳性细胞数明显增加。见图2。

图2 免疫组化检测BDNF组SH-SY5Y细胞中的表达 (×200)

2.4Western 印迹法检测SH-SY5Y细胞BDNF的表达结果 由图3可见，H2O2组SH-SY5Y细胞BDNF的表达明显较正常对照组减少，而SPE-L组和SPE-H组细胞中BDNF表达均较H2O2组明显升高，呈剂量依赖性，与H2O2组比较差异有显著性意义(tL=-5.984,PL=0.004;tH=-10.636,PH=0.000)。见图3。

图3 4组SH-SY5Y细胞中BDNF蛋白质的表达

3 讨 论

氧化应激诱发的自由基损伤是导致神经元凋亡的基本原因之一，因此抗氧化是保护神经元的有效途径。H2O2是氧化应激反应密切相关的活性氧之一，其主要产物具有很强的氧化性并可自由进入细胞，在许多神经元细胞培养模型中可引起细胞损伤，且许多中枢神经系统疾病都涉及氧化应激损伤〔5，6〕。细胞内氧化系统与抗氧化系统失衡，导致活性氧在细胞中累积是氧化应激的主要特征之一。H2O2氧化应激诱导SH-SY5Y细胞损伤与细胞内活性氧增多、线粒体功能失常等因素有关〔7〕。实验证明，用1.54 mmol/L H2O2处理SH-SY5Y细胞，可以引起细胞存活率明显降低。

BDNF基因定位于人类11号染色体1区3带，BDNF主要由脑组织合成的一种碱性蛋白质，分布于中枢神经系统，如海马、皮质、纹状体、基底前脑、丘脑、脑干和小脑中。近来发现周围神经系统也有BDNF的合成〔8〕。BDNF不仅在中枢神经系统发育过程中对神经元的生存、分化、生长和维持神经元正常的生理功能起关键作用，而且还具有抗伤害性刺激，促使神经元损伤后的再生等作用〔9〕。近年来研究表明，BDNF不仅能维持发育及促进成年神经元存活〔10，11〕，还在营救损伤神经元〔12，13〕，促进神经再生〔14〕，促进突触重建〔15〕，参与胶质细胞损伤〔16〕，改进神经行为学〔17～19〕等方面发挥着调节作用。从其功能看，BDNF应该在神经损伤修复治疗中有良好的应用前景。本研究发现，H2O2既可引起SH-SY5Y细胞存活率的下降，同时也使细胞内BDNF表达降低，表明二者之间存在着相关性。

在对脑缺血的研究中，许多中药具有提高内源性BDNF的作用。复方麝香注射液有明显促进BDNF含量增加的作用，并使其作用时间延长〔20〕。醒脑解毒汤能上调大鼠局灶性脑缺血再灌注模型脑组织中BDNF mRNA表达，改善急性期缺血性中风大鼠脑组织的缺血情况〔21〕。夏天无可通过调节BDNF的表达发挥脑神经保护作用从而使脑梗死大鼠的脑组织病理形态改善，对脑梗死模型大鼠起到治疗作用〔22〕。电针刺激能改善抑郁症大鼠的行为学及海马神经元的病理变化,证明CREB-BDNF受体后信号转导通路是针刺抗抑郁的重要途径和作用靶点之一〔23〕。蜗牛提取物通过干扰病毒吸附和穿入宿主细胞等机制明显抑制HBV复制的作用，且无细胞毒性〔24〕。Tsoutsos等〔25〕采用蜗牛提取物用于治疗开放性创伤和面部深度烫伤，发现蜗牛提取物可以促进开放性创伤和深度烫伤的皮肤愈合，提示蜗牛提取物中某些成分可促进组织细胞修复和再生。本研究发现，无论是低剂量还是高剂量的SPE均具有抗氧化作用，能够抑制H2O2引起的细胞毒性作用，并且可明显提高细胞的存活率，显示出SPE具有保护神经细胞的作用，为进一步研究SPE的神经保护作用提供了依据。

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