雄性小鼠生精细胞在不同浓度甘草液培养下生物学特征观察

李 伟 胡红梅 杨亚军 杨赣军 孙 弋 孙新明

(井冈山大学临床医学院，江西 吉安 343000)

男性生殖毒性的研究中，环境污染(如蔬菜中农药、洗涤剂、家庭常用餐具)引起的雌激素样物质浓度升高等对男性生殖健康的威胁越来越引起人们的重视；近代药理研究发现，不少临床常用的中药具有雌激素样功效，如甘草、补骨脂等可促进雌性动物乳腺发育和子宫明显增重及血清雌激素水平升高〔1〕，其雌激素样作用是否与环境雌激素一样具有男性生殖毒性的作用，目前未见报道。研究旨在探讨中药材雌激素样作用对睾丸的毒性作用，为研究男性不育不孕症的发生机制及甘草等含雌激素样作用中药材的临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1采用清洁级BABL/c雄鼠20只(购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司)；市售药用甘草采用超声提取法和树脂吸附技术自制成浸膏(含甘草提取物62.5 mg/ml)后用磷酸盐缓冲液(PBS)配制成10 mg/ml药物浓度，过滤除菌，置冰箱冷藏备用；实验在井冈山大学医学院中心动物实验室〔实验动物使用许可证号：SYXK(赣)2012-0001〕完成。主要试剂：DMEM培养液、Percoll细胞分离液(Gibco公司)；优质胎牛血清(Hyclone公司)；MTT试剂盒(上海创翼生物科技有限公司)；姬姆萨染色液(380050-G)。

1.2方法

1.2.1小鼠生精细胞的分离培养 按照文献〔2〕的方法分离培养小鼠生精细胞：在无菌条件下取出生后6～8 d小鼠(约10只)双侧睾丸，放人无菌平皿中，在加有1%青霉素和链霉素的PBS中剥离睾丸白膜；将分离后的组织放人加有P B S的离心管，用吸管吹打以分散曲细精管；用D-hanks液配制的1 g/L胶原酶Ⅳ加入离心管中(体积共2.5 ml)，将离心管置入37℃ 5% CO2培养箱中15 min，然后 1 000 r/min离心1 min后除去上清，加入1 g/L透明质酸酶和0.25%胰蛋白酶，转入无菌培养皿中，放入37℃ 5%CO2的培养箱5 min后取出，显微镜下观察到大量游离的单细胞和小细胞团；转入无菌离心管，加入含有10%(BBS)和1%青霉素和链霉素的DMEM培养液至总体积为10 ml；1 300 r/min离心5 min，弃上清后再加入10 ml DMEM培养液；用100 μm滤网过滤后将滤液转入离心管，1 300 r/min离心5 min；弃上清，向细胞加入0.5 ml DMEM培养液制成单细胞悬液，采用Percoll梯度分离液分离精原细胞。

1.2.2密度梯度离心 分别制备密度为1.021、1.031、1.043、1.056、1.067和1.079 g/ml的Percoll梯度液，再用长针头注射器将已制备好的每组Percoll梯度液按密度从高到低逐层放置到10 ml离心管中。将细胞悬液置于最上层，以1 400 r/min离心25 min。用吸管将位于1.056和1.067梯度间的细胞带取出，移至另一10 ml离心管中。加入5倍体积的D-Hanks液稀释，以1 000 r/min离心10 min，弃上清，重复上述过程2次。再加入2 ml新鲜培养液，调整细胞密度至3×106个/ml，由此制备的细胞悬液中，多数为生精细胞。

1.2.3生精细胞的培养 将调整好细胞密度的细胞悬液接种于放置有多聚赖氨酸处理的盖玻片的6孔培养板中，每孔1.5～3 ml，置CO2培养箱中(37℃、5%CO2、95%空气)培养。24 h后首次换液，以后每隔1 d换液。

1.2.4生精细胞的形态学观察 在倒置相差显微镜下观察细胞的形态学改变并拍片记录。

1.2.5生精细胞姬姆萨染色 细胞培养达到指定时间后，姬姆萨染色。配置工作液：PBS 1 ml，蒸馏水9 ml混匀，即可。取出细胞，用甲醇固定 2～3 min； 将细胞爬片放置染色架上，滴加稀释好的染色液，使覆盖全部细胞，室温染色15～30 min。 用自来水缓慢从玻片一端冲洗(注意勿先倒去染液或直接对细胞冲洗)，晾干后镜检。

1.2.6MTT法检测细胞毒性 在96孔板加入细胞100 μl/孔(约1×104)，置37℃ 5%CO2细胞培养箱中培养24 h；加入适当浓度的受试化合物；将96孔板在37℃，含5%CO2及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间；将5×MTT用 Dilution Buffer稀释成1× MTT；每孔加50 μl 1× MTT，在37℃孵育4 h，使MTT还原为甲臜；吸出上清液，每孔加150 μl DMSO使甲臜溶解，用平板摇床摇匀；酶标仪在570 nm波长处检测每孔的光密度。

1.3统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行方差分析。

2 结 果

2.1形态学观察 生精细胞接种后大部分悬浮在基质细胞饲养层上，少量的开始黏附，细胞呈圆形； 12 h后见有少量体积较大的悬浮细胞开始死亡，体积较小的贴壁细胞开始分裂增殖，增殖的细胞大小均一，可呈单个或链状，细胞间可见由于细胞在分裂时胞质未完全分开形成的细胞间桥，见图1，图2，图3，这与文献报道的精原干细胞的形态学特征相符合〔2〕。

2.2姬姆萨染色结果 姬姆萨染色显示生精细胞形态完整，呈圆形，胞质呈灰色，胞核较圆，胞膜边界较清晰，加药组细胞染色相对正常组变浅，核染色质着色物质变弱变少。

图1 对照组生精细胞形态(相差显微镜，×400)

图2 含药物1 μg/ml实验组生精细胞形态(相差显微镜，×400)

图3 含药物60 μg/ml实验组生精细胞形态(相差显微镜，×400)

2.3MTT法检测不同浓度甘草浸膏对于生精细胞的毒性作用 含药物1、 10、100 μg/ml的实验组培养24 h的细胞成活率分别为87.0%。MTT均值0.459、68.6%，MTT均值0.365、46.5%，MTT均值0.251。

3 讨 论

在男性生殖毒性的研究中，环境污染(如蔬菜中农药、洗涤剂、家庭常用餐具)引起的雌激素样物质浓度升高等对男性生殖健康的威胁越来越引起人们的重视；而具有雌激素样功效的常用中药-甘草是否与环境雌激素一样具有男性生殖毒性的作用，这非常值得探讨，本实验按照文献〔2〕的方法分离培养小鼠生精细胞，并分为对照组和实验组，实验组的培养液是在对照组的基础上分别加1、10、100 μg/ml的甘草浸膏，以观察其生物学特征，结果表明细胞生长分裂受到一定得抑制或有些细胞凋亡，随着药物浓度的增加，细胞成活率逐渐下降，到了100 μg/ml时，细胞成活率不及50%。这进一步说明甘草对男性生殖细胞有一定的毒害作用，且随浓度的增加而增加。甘草主要成分有甘草酸、甘草甙等，具有抗炎、抗病毒，和保肝解毒及增强免疫功能等作用，甘草酸有糖皮质激素样药理作用而无严重不良反应，甘草酸还具有降血脂与抗动脉粥样硬化作用，阻止动脉粥样硬化的形成，现代临床也应用甘草于补肾生精合剂、生精汤中〔3〕，但甘草对生精细胞的具体作用机制及是否有可逆性将需要作进一步的研究。

4 参考文献

1孙 岩，尤 君.注意甘草甜素的不良反应〔J〕.中国误诊学杂志，2008；8(12):3018.

2张小丽，高英茂，赵舒武，等.生精细胞的体外培养〔J〕.山东大学学报，2005；43(10):881-4.

3张宏伟.生精汤联合复方甘草锌胶囊治疗弱精症的临床分析〔J〕.山西医药杂志，2007；36 (3):200.