蛇床子素对大鼠肝癌动物模型肝细胞生物行为学特性及血管特征的影响

苏立平,薛明明△,陈立,苏立军,祁朋,何蕾

(1.内蒙古医科大学基础医学院 基础医学实验室,内蒙古 呼和浩特 010059;2.中国国际航空内蒙古分公司 航医室,内蒙古 呼和浩特 010070;3.内蒙古医科大学附属医院 生殖中心,内蒙古 呼和浩特 010059)

蛇床子素对大鼠肝癌动物模型肝细胞生物行为学特性及血管特征的影响

苏立平1,薛明明1△,陈立2,苏立军3,祁朋3,何蕾3

(1.内蒙古医科大学基础医学院 基础医学实验室,内蒙古 呼和浩特 010059;2.中国国际航空内蒙古分公司 航医室,内蒙古 呼和浩特 010070;3.内蒙古医科大学附属医院 生殖中心,内蒙古 呼和浩特 010059)

目的 探讨蛇床子素对二乙基亚硝胺致癌和Walker-256移植瘤Wistar大鼠的生物行为学特性及血管特征的影响。方法 选取造模成功的二乙基亚硝胺致癌和Walker-256移植瘤的Wistar大鼠各20只，前者均分为A组和C组，后者均分为B组和D组，A、B 2组给予等体积的生理盐水灌胃，为对照组；C、D 2组给予2.5μg/（g·d)蛇床子素灌胃，为治疗组。治疗4周后，对各组进行微血管直径的测量，肿瘤微血管密度的计数，肿瘤直径的测量，肿瘤分化程度评价以及血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达。结果 治疗4周后，C组肿瘤直径较A组明显降低（P＜0.01)，D组肿瘤直径较B组有一定程度的降低（P＜0.05)；C组较A组，D组较B组大鼠的门脉癌栓率均显著性降低（P＜0.01)；2治疗组肿瘤细胞分化程度有一定程度的升高，但与对照组比较差异无统计学意义；微血管密度和微血管直径C组较A组，D组较B组均有一定程度的降低（P＜0.05)。C组较A组，D组较B组肿瘤瘤块体积均明显降低（P＜0.01)。A、B组血管内皮细胞VEGF呈现高表达状态，C、D组经过蛇床子素4周治疗后，血管内皮细胞VEGF的表达均明显降低。结论 蛇床子素可通过影响肝细胞癌生物行为学特性及血管特征而抑制2种肝癌实验动物模型肝癌的生长。

蛇床子素；肝癌；生物行为学

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)在世界范围内是第五大常见肿瘤,且发病率还在逐年增加［1］。目前仍以手术切除和化疗药物治疗为主,但是化疗药物能够引起众多不良反应,且多是不可避免的。许多从天然植物中提取的化学成分能够抑制多种肿瘤细胞的增殖,本研究中的蛇床子素是中药蛇床子的主要有效成分,具有抑制肺腺癌肿瘤生长的作用［2］。本研究旨在探讨蛇床子素对二乙基亚硝胺致癌和Walker-256移植瘤的Wistar大鼠肝细胞癌生物行为学特性及血管特征的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和细胞:雄性Wistar大鼠6周龄,体质量120～200 g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,合格证号:SCXK(京)2013-0001。饲养条件:于无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级分笼饲养,每笼2～4只,采用自然光照,并定时通风,保持环境清洁,温室保持在19℃～23℃,相对湿度为70%～80%。本实验严格遵循《实验动物保护条例》的相关规定。

Walker-256细胞由上海拜力生物科技有限公司提供。

1.1.2 试剂和药材:蛇床子素由江苏永健医药科技有限公司提供,使用时用N,N-二甲基甲酰胺溶解,采用吐温80助溶,溶解比例为:N,N-二甲基甲酰胺∶吐温80∶生理盐水=1∶1∶8,使用前用生理盐水稀释至所需浓度。注射二乙基亚硝胺(Sigma公司)。免疫组化超敏 S-P试剂盒购自美国 Maxim公司。nm23-H(美国Maxim公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立:二乙基亚硝胺致癌大鼠模型的建立参照Park等［3］所报道的方法并在具体操作时稍加改进。即:模型组大鼠腹腔注射二乙基亚硝胺溶液(50mg/kg,用生理盐水超声溶解至0.1mL),2次/周,连续注射4周后,改为同样剂量的1次/周,到第14周结束后,随机处死1只大鼠,检查肝脏出现癌灶者则造模成功。

Walker-256移植瘤大鼠模型建立:Walker-256细胞复苏培养,调整细胞浓度为1×107个/mL,取0.2 m L注射于大鼠右后腿皮下,每隔1周测量瘤体的长度(L)和宽度(W),瘤体体积计算［4］:V(mm3)=0.5236 ×L(nun) ×W2(mm2)。 瘤体体积至(100±20)mm3时开始实验。

1.2.2 治疗方法:将20只二乙基亚硝胺致癌成功的Wistar大鼠随机分为A组和C组,20只Walker-256移植瘤成功的Wistar大鼠随机分为B组和D组,A、B 2组给予生理盐水,为对照组;C、D 2组给予2.5μg/(g·d)蛇床子素灌胃,为治疗组。治疗4周后,采用吸入乙醚法处死大鼠,剖取癌灶及距癌灶边缘1 cm癌旁组织,用10%甲醛溶液固定,标本保存在-80℃冰箱。

1.2.3 检测指标:肝癌生物行为学特性:治疗4周后,切除各组肝癌组织,检测肿瘤直径、门脉癌栓和肿瘤细胞分化程度生物行为学特性参数。

肝癌组织微血管密度和微血管直径:对切除的肝癌组织,行肝癌组织切片,连续切取5μm厚的3张切片,其中1张进行常规HE染色,另外2张进行血管内皮细胞的免疫组化染色。利用显微镜寻找切片血管高密度区,计数被染成棕色的血管数目,每个高密度区计数3个视野,最高值即为微血管密度值。显微镜下,于血管高密度区随机测量5个相同倍数视野下的血管,计算最大横径的平均值,即为肿瘤微血管直径。

免疫组织化学法观察各组肝癌组织中血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达。各组处理后的切片采用S-P法进行VEGF表达的检测,一抗(1∶500)使用nm23-H(美国Maxim公司),按照试剂盒说明书进行操作,以细胞内出现黄棕色颗粒即为阳性细胞。

肿瘤瘤块体积测定:瘤块体积(tumor volume,TV)采用公式:TV=(a×b)2/2计算,其中a代指瘤体的长,b代指瘤体的宽。

1.3 统计学方法 使用SPSS19.0软件处理统计数据,正态计量资料以“±s”表示,进行t检验,计数资料组间对比采用χ2检验;以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肝细胞癌生物行为学特性及血管特征 经过蛇床子素4周治疗后,C组肿瘤直径较A组明显降低,差异有统计学意义(P＜0.01),D组肿瘤直径较B组有一定程度的降低,差异有统计学意义(P＜0.05);大鼠门脉癌栓情况,C组较A组,D组较B组均明显降低,差异有统计学意义(P＜0.01);肿瘤细胞分化程度有一定程度的升高,差异没有统计学意义(见表1)。微血管密度和微血管直径C组较A组,D组较B组均明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1 各组肝细胞癌生物行为学特性及肝细胞癌血管特征Tab.1 Bio-behavioral characteristics of hepatocellular carcinoma and The vascular characteristics of hepatocellular carcinoma in each group

2.2 各种肿瘤瘤块体积测定 经过蛇床子素4周治疗后,治疗组(C、D组)较对照组(A、B组)肿瘤瘤块体积均有明显的降低,差异有统计学意义(P＜0.01,见图1)。

图1 肿瘤瘤体体积**P＜0.01,与A组比较;##P＜0.01,与B组比较Fig.1 The tumor volume of tumor block**P＜0.01,compared with group A;##P＜0.01,compared with group B

2.3 各组VEGF表达检测结果 免疫组化结果显示:A、B组肝癌组织细胞内出现大量黄棕色颗粒(文中箭头所示,见图2A,2B),C、D组肝癌组织细胞内黄棕色颗粒明显减少(见图2C,2D),表明A、B组血管内皮细胞VEGF呈现高表达状态,经过蛇床子素4周治疗后,血管内皮细胞VEGF的表达明显降低。

图2 各组VEGF表达检测Fig.2 Immunohistochemistry assay results of VEGF expression in each group

3 讨论

中药在我国有着悠久的历史,其在肿瘤治疗方面发挥着越来越重要的作用,其中不乏治疗肝癌的药物［5-6］。蛇床子素又称甲氧基欧芹酚,属于香豆素类化合物,而香豆素已被证实具有抗肝癌的效果［7］。国内外研究表明,蛇床子素不仅具有抗肝炎、抗骨质疏松等作用［8-9］,而且可以通过诱导多种肿瘤细胞的凋亡而抑制肿瘤增殖［10］。研究显示:蛇床子素对肺癌裸鼠模型的实体瘤的生长具有一定的抑制作用,而对小鼠的肝、肾、脾指数影响甚微,体现蛇床子素低毒的特点［2］。

肿瘤的恶性程度与其分化程度有关［11］,有报道显示中药可促进肝癌细胞的分化而降低其恶性程度［12］。本研究发现蛇床子素具有抑制2种肝癌动物,即二乙基亚硝胺致癌和Walker-256移植瘤的Wistar大鼠肝癌细胞的生长作用,使肝癌细胞高分化,从而降低其侵袭能力,但其促使肝癌细胞高分化的机制仍不清楚,需要进一步研究。肿瘤的生长伴随着大量微血管的形成［13］,本研究发现蛇床子素能降低肿瘤微血管密度,减小微血管直径,从而抑制肿瘤的生长。本研究还通过免疫组化实验证实,蛇床子素能够降低肝癌血管内皮细胞VEGF的表达,这可能是其影响肿瘤微血管作用的原因,但具体机制仍需进一步研究。

综上所述,蛇床子素对肝癌实验动物模型的肿瘤具有一定的抑制作用,且可抑制血管内皮细胞VEGF的表达,具体机制有待进一步研究。

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(编校:吴茜，王俨俨)

Effect of osthole on the bio-behavioral characteristics and vascular characteristics in hepatocellular carcinoma model rat

SU Li-ping1,XUE Ming-ming1△,CHEN Li2,SU Li-jun3,QIPeng3,HE Lei3

(1.Laboratory of Basic Medical Science,Inner Mongolia Medical University,Hohhot010059,China;

2.Aviation Medical Center,Inner Mongolia Branch of Air China,Hohhot010070,China;

3.Reproductive Center,Inner Mongolia Medical University,Hohhot010059,China)

Objective To investigate the effectof osthole on the bio-behavioral characteristics and vascular characteristics in N-nitrosodiethylamine and Walker-256 transplantable tumorWistar rats.Methods 20 ratswith N-nitrosodiethylamine-induced tumor were divided into A,C group,another 20 ratswith Walker-256 transplantable tumorWistar ratswere divided into B,D groups,each had 10 rats.Rats in group A and Cwere given certain saline as control groups,and rats in group B and D were given 2.5μg/(g·d)osthole gavage treatment.After 4 weeks treatment,capillary diameter,tumor microvessel density,tumor diameter,tumor differentiation ofeach group weremeasured and the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)in each group weremeasured by immunohistochemistry assay.Results After4 weeks osthole treatment,tumor diameter of group Cwas significantly lower than that of group A(P＜0.01),and group Dwas significantly lower than thatofgroup B(P＜0.05).Ratio of portal thrombosis in group C and Dwere significantly lower than thatof group A and group B,respectively(P＜0.01).The degree of tumor cell differentiation were increased in group C and D,and there were no significant difference with two control group.Microvascular density and microvascular diameter in group C and D were significant lower than that in group A and B,respectively(P＜0.05).Tumor volumes in treatment groups(C and D)were significantly lower than that in control groups(A and B,P＜0.01).VEGF showed high expression in group A and B,and decreased in groups C and D after 4 weeks osthole treatment.Conclusion Osthole could inhibit hepatocellular carcinoma growth in two experimental animal models by influencing the bio-behavioral characteristics of hepatocellular carcinoma and vascular characteristics.

osthol;hepatocellular carcinoma;vascular;bio-behavioral characteristics

苏立平，男，硕士，实验师，研究方向：基础医学实验，E-mail：suliping1975@163.com；薛明明，通信作者，女，教授，研究方向：生理学，E-mail：1072730663@qq.com。

R285.5；R730

A

1005-1678（2014)06-0035-03

内蒙古自治区自然科学基金项目(2013MS1143)