吡咯喹啉醌对兔骨关节炎关节软骨保护机制的研究

王来芳,丁艳杰,赵清Δ,陈丽娟

(1.河南大学淮河医院 风湿免疫科,河南 开封 475000;2.南京医科大学 医学科学部,江苏 南京 210029)

吡咯喹啉醌对兔骨关节炎关节软骨保护机制的研究

王来芳1,丁艳杰1,赵清1Δ,陈丽娟2

(1.河南大学淮河医院 风湿免疫科,河南 开封 475000;2.南京医科大学 医学科学部,江苏 南京 210029)

目的 研究吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ)对兔骨关节炎关节软骨的保护机制。方法 6月龄日本大耳白兔36只为实验对象，随机分为实验组、对照组及伪手术组（每组12只)。观察软骨大体形态并行软骨Pelletier JP评分；制备切片行HE染色，光镜下观察HE切片并按照Mankin评分表对其评分；行II型胶原免疫组化染色，光镜下观察II型胶原表达情况；行软骨细胞凋亡检测（TUNEL法)，在光镜下观察软骨细胞凋亡情况；通过透射电镜观察软骨细胞线粒体形态和数目的改变。结果 实验组和对照组的Kellgren-Lawrance评分差异有显著性（P＜0.05)；实验组电镜下软骨细胞线粒体数多于对照组。结论 关节腔内注射PQQ可保护软骨细胞，从而减轻关节软骨结构及功能的破坏，促进软骨的代谢和自身修复，防止关节软骨退变。吡咯喹啉醌可能是通过保护软骨细胞线粒体而发挥作用的。

骨关节炎；吡咯喹啉醌；软骨细胞

骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种多见于老龄人的常见慢性疾病,我国50岁以上人口OA发病率逐年升高,国外60岁以上发病率高达78%。伴随社会人口老龄化进程的加速,OA发病人数将日益增多,越来越多的人将饱受OA的困扰。OA将成为降低老年人生活质量的主要原因之一,现已引起社会和医学界的高度重视。OA的特征性病理变化是关节软骨的破坏,其本质是关节软骨的生成与骨的破坏和修复相互交替的复杂过程。吡咯喹啉醌最先被 Hauge等［1］发现,它是 Salisbury和 Duine［2-3］从甲基营养菌体内的甲醇脱氢酶中提取获得的。在动植物和人体内都含有一定量的PQQ［4-6］,对动植物的生存起重要作用。PQQ作为电子的供体和受体参与氧化还原反应过程,它可以催化连续的氧化还原过程,在许多生物体的氧化还原反应起重要作用［7］,在还原剂的存在的情况下,PQQ可诱导发超氧化还原反应。而在氧化应激情况下,它又可以发挥氧化作用而防止细胞损伤［8-10］。本研究利用PQQ进行动物骨关节炎的干预处理,旨在观察PQQ对兔骨关节炎关节软骨是否具有保护作用,并对其可能的效应机理作出探讨,从而为PQQ骨关节炎关节软骨的保护应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及设备 鼠抗兔II型胶原抗体(北京博奥森生物技术有限公司)、TUNEL凋亡试剂盒(Invitrogen公司、美国)、吡咯喹啉醌(Sigma公司、美国)等。石蜡包埋机、切片机、恒温箱、冰箱、烤箱、手术小圆刀、眼科剪、眼科镊、皮拉勾、浅肌钩、刀柄、有齿镊、无齿镊、血管钳、持针器等。

1.2 实验动物 6月龄健康日本大耳白兔36只雌雄均可,平均体质量2.4 kg(购自武汉大学第一临床学院实验动物室,SPF级,动物实验合格证编号SCXK2008-0003),分笼饲养。动物房温度22℃～26℃,饲料供给充足,笼中饮用水充足、卫生。

1.3 实验方法 实验动物造模方法:将实验动物置动物房适应性饲养3 d之后,用3%戊巴比妥纳35mg/kg静脉麻醉,右侧膝关节行经典Hulth法造模:麻醉起效后将其固定在手术台上,术区备皮,活力碘消毒后常规铺巾。取右膝关节内侧髌骨旁切口,切开皮肤,皮下筋膜和关节囊,暴露前交叉韧带。直视下切断前交叉韧带、内侧半月板、和内侧副韧带,注意不要损伤关节软骨。行抽屉试验确认前交叉韧带已完全切断后,生理盐水冲洗后将髌骨复位,用4-0丝线缝合关节囊和皮肤。术后第二天实验动物即恢复正常活动。伪手术组仅打开关节囊,不损伤关节软骨、交叉韧带、内侧半月板和内侧副韧带,然后用生理盐水反复冲洗后逐层关闭切口,行抽屉实验与左侧膝关节对比以确认前交叉韧带已完全切断。

实验动物分组和给药:术后将实验动物分为3组,分别为实验组、对照组及伪手术组,每组12只。实验组给术侧膝关节腔内注射104μmol/L吡咯喹啉醌0.2mL/kg,每3天注射1次,连续6周。对照组术后给膝关节腔内注射等量的生理盐水,每3天注射1次。伪手术组不给予药物处理。

标本采集前检测及标本大体观察:手术后第6周,将各组动物用3%戊巴比妥纳35mg/kg静脉麻醉后,仰卧位行膝关节正位X线片,并根据Kellgren-Lawrance分级标准进行评分,完成X线检测,空气栓塞法将实验动物处死。肉眼大体观察并记录股骨髁关节面的病理改变,并行软骨Pelletier JP评分。

相关实验切片制备准备:处死全部动物并大体观察后,截取右膝股骨下端,剔除周围软组织,冲洗干净将组织浸泡在10%的中性福尔马林中,4℃下固定24 h;脱钙固定完成后,PBS充分浸洗,流水冲洗2 h,15%乙二胺四乙酸二钠溶液(EDTA)脱钙,每5天更换脱钙液,4周后针刺组织无明显阻力感,说明脱钙已完全。修整组织块,保留股骨内侧髁,流水冲洗1～2 h;脱水梯度酒精脱水:冲洗后的标本入70%酒精2 h,80%酒精2 h,95%酒精2 h,95%酒精2 h,无水酒精2 h,无水酒精2 h;透明二甲苯中冲洗2次,每次20min;浸蜡组织透明后取出放入事先融化好的56℃的石蜡中浸蜡两次,每次30min;包埋浸蜡完成后,将组织放入装满融化石蜡的包埋框中,冷却;切片将蜡块装到切片机上,切片厚度定为5μm,行关节软骨和软骨下骨全层不连续切片,每个标本切9张,间隔100μm切片。用摄子轻轻将切片放入47℃温水中展平,捞片。

1.4 统计学方法 统计分析采用SPSS13.0统计软件进行处理,正态计量数据用“±s”表示,多样本均数比较采用单因素方差分析;以P＜0.05差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 X线摄片检测膝关节影像学改变 伪手术组(图1A)见股骨髁软骨表面光滑且无骨质增生迹象,关节间隙无明显改变。实验组(图1B)见股骨内髁边缘模糊,关节间隙较伪手术组小,可见少量骨质增生,且胫骨平台表面欠光滑。对照组(图1C)见关节间隙明显变窄,软骨骨化严重,有大量骨赘,且有毛刺样增生,胫骨平台骨质破坏严重。

通过3组X线片影像学积分可知,伪手术组(1.46±0.42)分,实验组(0.08±0.04)分,对照组(2.75±0.60)分,实验组积分较对照组低,差异有统计学意义(P＜0.05)。

关节软骨切片的染色:骨组织石蜡切片脱蜡入水,蒸馏水洗;苏木素染液染细胞核5～10min;水洗,去除余色;1%盐酸酒精分色数秒;流水漂洗,直至组织切片充分蓝化;伊红染液染细胞质2min,自来水冲洗;入梯度酒精脱水;二甲苯透明,中性树胶封片。

图1 X线摄片检测膝关节影像学改变Fig.1 X ray radiography testing knee imaging changes

2.2 大体观察 伪手术组(图2A)软骨表面光滑,透明度高,未见溃疡和软骨缺损。实验组(图2B)膝关节股骨内髁关节面大部分平整,部分部位可见达软骨缺损,及少量骨赘生成。对照组(图2C)可见关节面粗糙不平整,无光泽,颜色暗红,部分软骨表面可见深达软骨中层和深层的裂隙和缺损,软骨面结构几乎完全破坏,多处软骨剥脱且可见软骨下骨,并且可以见大量骨赘生成。

图2 胫骨关节面大体观察Fig.2 Tibial articular surface gross observation

2.3 光镜下观察HE染色 伪手术组(图3A)软骨基质染色均匀,软骨表面无裂隙,细胞排列有序,结构清晰、无细胞簇集现象。实验组(图3B)软骨细胞局部弥漫增生簇集,软骨细胞减少,排列紊乱等。对照组(图3B)软骨表中层细胞数弥漫性增多,并出现簇集样细胞团,部分标本软骨表面出现裂隙及深达中层的糜烂。

图3 HE染色软骨光镜下观察结果Fig.3 Observation results of cartilage HE staining under lightmicrosoope

2.4 TUNEL法检测软骨细胞凋亡结果 从对照组(图4C)可见软骨细胞凋亡数明显多于实验组(4B),而伪手术组(图4A)偶见凋亡的软骨细胞。由图4可见,伪手术组:正常的软骨细胞II型胶原均匀分泌、胶原纤维密集、平行分布。实验组:软骨细胞II型胶原合成介于伪手术组和对照组之间。对照组:软骨浅层II型胶原缺失。

图4 PQQ对软骨细胞II型胶原合成的影响Fig.4 PQQ effects on collagen synthesis of cartilage cell type II

2.5 软骨细胞线粒体在电镜下的形态和数目的改变 从实验组(图5A)可见线粒体较对照组显著增多,而对照组(图5B)软骨细胞线粒体在视野中未见。

图5 软骨细胞线粒体在电镜下的改变Fig.5 Cartilage cellsmitochondrial changes under electron microscope

3 结论

吡咯喹啉醌对关节软骨保护作用的机制尚属探索阶段。有许多试验报告显示,软骨细胞生存依赖能量代谢,软骨基质的合成与矿化是由ATP生成与消耗的动态平衡所调节的。因此软骨细胞内线粒体是能量的重要的细胞器,因此ATP生成和消耗失衡不仅影响基质的合成,而且会导致软骨的钙化。

吡咯喹啉醌是一种氧化还原酶的辅酶。动植物体内和人体内都含有一定量的PQQ,它参与广泛的生物学功能,在氧化应激环境下,它可发挥抗氧化作用而防止细胞受损［11］,同时 Stites［6］、Rucker［10］等国外科学家研究表明PQQ可以促进线粒体的生成。本研究可以观察到在实验组透射电镜线粒体数量明显高于对照组,从而证明PQQ具有保护或促进线粒体生成效应,提示它可以治疗线粒体功能不足所造成的相关疾病,从而起到保护关节软骨的作用。软骨细胞线粒体对软骨细胞的凋亡也有重要作用,主要与能量代谢也有关系。胶原是软骨的主要组成部分,而II型胶原占软骨干重的约60,且II型胶原是维持软骨空间网络结构的重要部分,故II型胶原量的改变对OA的形成是一项很重要的因素,如果II型胶原减少必定引起关节软骨的改变,本实验发现PQQ可以促进II型胶原的合成或减少II型胶原的分解,因此这也是吡咯喹啉醌保护软骨的作用机制之一。

OA最主要的病变是关节软骨的退变,现阶段的主要治疗手段除了严重的OA通过手术来解决以外,其他治疗方法主要是缓解炎症和保护骨关节软骨。而本实验正是通过保护膝关节软骨来治疗OA的,且实验结果证实,PQQ对OA的预防和治疗有一定的疗效。

目前,本研究在国内首次采用兔关节腔内注射PQQ来进行OA治疗的研究,实验发现PQQ可以有效控制骨关节软骨的退变,但是机理不是完全清楚,将做进一步的研究。同时,本实验所给关节腔PQQ的浓度是否为最佳治疗浓度,也不是完全的清楚,需要进一步的研究。

［1］ Hauge JG.Glucose dehydrogenase of bacterium anitratum:an enzyme with a novel prosthetic group［J］.J Biol Chem， 1964， 239（2):3630-3639.

［2］ Salisbury SA，Forrest HS， Cruse WB， et al.A novel coenzyme from bacterial primary alcohol dehydrogenases［J］.Nature， 1979， 280（5725):843-844.

［3］ Westerling J，Frank J， Duine JA.The prosthetic group of methanol dehydrogenase from Hyphomicrobium X:electron spin resonance evidence for a quinone structure［J］.Biochem Biophys Res Commun，1979，87 （3):719-724.

［4］ Matsushita K，Toyama H，Yamada M，et al.Quinoproteins:structure，function， and biotechnological app lications［J］.App lMicrobiol Biotechnol， 2002， 58（1):13-22.

［5］ Anthony C.Pyrroloquinoline quinone（ PQQ)and quinop rotein enzymes［J］.Antioxid Redox Signal， 2001， 3（1):757-274.

［6］ Stites TE， Mitchell AE， Rucker RB.Physiological importance O-quinone family of cofactors［J］.JNutr， 2000， 130（1):719-727.

［7］ Bishop A，Gallop PM，Karnovsky ML，etal.Pyrroloquinonline quinine:a novel vitamin? ［J］.Nutr Rev， 1998， 56（2):287-293.

［8］ Zhang Y，Rosenberg PA.The essential nutrient Pyrroloquinoline quinine may actas a neuroprotectant by suppressing peroxynitrite formation［J］.Eur JNeurosci， 2002， 16:1015-1024.

［9］ He K，Nukada H， Urakami T， et al.Antioxidant and pro-oxidant properties of Pyrroloquinoline quinine（PQQ):implications for its function in biological systems［J］.Biochem Pharmacol，2003， 65（1):67-74.

［10］ Rucker R， Chowanadisai W.and Nakano M.Potential Physiological Importance of Pyrroloquinoline Quinone［J］.ALTERNATIVE MEDICINE REVIEW，2009，14（3):268-277.

［11］ Stites T， Storms D， Bauerly K， et al.Pyrroloquinoline quinine modulatesmitochondrial quantity and function in mice［J］.J Nutr，2006， 136（2):390-396.

［12］ Rucker RB，Chowanadisai W， Tchaparian E， et al.Pyrroloquinoline quinine and mitochondriogenesis［J］.Mitochondrion， 2009，14（3):268-277.

［13］ ChowanadiaiW，Bauerly K， Tchaparian E， et al.Pyrroloquinoline quinone（PQQ)stimulates mitochondrial biogenesis［J］.Faseb Journal， 2010，285（1):145-152.

［14］ ChowanadisaiW，Bauerly KA，Tchaparian E，et al.Pyrroloquinoline Quinone Stimulates Mitochondrial Biogenesis through cAMP Response Element-binding Protein Phosphorylation and Increased PGC-1 alpha Expression［J］.JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY， 2010，285（1):142-152.

［15］ Urakami T，Yoshida C， Akaike T， et al.Synthesis of monoesters of Pyrroloquinoline quinine and in idazopyrroloquinoline and radial scavenging activities using electron spin resonance in vitro and pharmacological activity in vivo［J］.JNutr Sci Vitaminol， 1997， 43（1):19-33.

(编校:谭玲)

Study on the protection mechanism of the pyrroloquinoline quinone for osteoarthritis on rabbits

WANG Lai-fang1,DING Yan-jie1,ZHAO Qing1△,CHEN Li-juan2

(1.Department of Rheumatology,The Huaihe Hospital of Henan University,Kaifeng 475000,China;
2.Division of Medical Sciences,Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China)

Objective To study the protectionmechanism of the pyrroloquinoline quinone(PQQ)for osteoarthritis on rabbits.Methods Sixmonths of aged 36 Japanesewhite rabbitsasexperimental subjects,were randomly divided into experimentalgroup and controlgroup and pseudo-operation group,each group had 12 rabbits.Knee anteroposterior X-ray film,and in accordance with Kellgren-Lawrance's grading score was observed under an operating microscope articular cartilage of femoral condyle parallelmorphological changes in the general rate of cartilage Pelletier JP,HE sections in the light microscope,and in accordance with the Mankin score sheet score,in the light microscope and the apoptosis of cartilage type II collagen immunohistochemical staining and electron microscopy of chondrocytes in the form.Results The experimental group Kellgren-Lawrance score was significantly lower than the control groups(P＜0.05);The experimental group and the control group cartilage cellmitochondria number had significant difference under electron microscope.Conclusion Intra-articular injection in osteoarthritis of PQQ to protect cartilage cells,thereby reducing the structure and function of articular cartilage damage and promote cartilagemetabolism and repair itself.PQQ may be to protect the articular cartilage by protecting cartilage Unitochondria.

osteoarthritis;pyrroloquinoline quinone;chondrocytes

R7

A

1005-1678（2014)06-0059-04

国家自然科学基金(81071946)

王来芳，女，本科，主治医师，研究方向：风湿，R-mail：qch1821460030@163.com。