应用直肠癌QPCR数据筛选差异表达基因并探索其与临床参数间的相关性

杨宏

(河北省唐山工人医院 放化疗科,河北 唐山 063000)

应用直肠癌QPCR数据筛选差异表达基因并探索其与临床参数间的相关性

杨宏

(河北省唐山工人医院 放化疗科,河北 唐山 063000)

目的 研究在直肠癌组织与正常直肠组织中的微小RNA（miRNA)表达差异，并分析其与临床指标的关系，探讨血清微小RNA在直肠癌中诊断和预后的应用价值。方法 选取12例直肠癌患者，手术后取癌组织标本，QPCR检测miRNA在直肠癌组织与癌旁组织中的表达，筛选具有差异表达的miRNA。通过聚类分析，并筛选出P＜0.001的miRNA，分析基因间的聚集性；并进一步探讨直肠癌患者临床病理参数、不同临床分期、有无淋巴结转移与筛选的miRNA之间的相关性。结果 在变化倍数＞1.6，P＜0.01的条件下初步筛选得到26个结肠癌患者具有差异表达miRNA，聚类分析P＜0.001下，筛选出3大类具有相似性的基因和3组具有相似性的个体。miRNA100、miRNA125a-5p、miRNA125b、miRNA145、miRNA145*和癌细胞淋巴转移有关系。miRNA9在肿瘤样本中高表达，在对应患者中随着vilin基因增高表达下调，表明其作为疾病相关的癌基因和疾病的发生机制有关。CK20指标和miRNA4770、miRNA4700-5p呈高度负相关（P＜0.05)。 结论 miRNA1，miRNA145，miRNA4799-5p，miRNA-4790-5p等 miRNAs可作为诊断的分子靶标指导结肠癌的诊断。microRN100，miRNA145等miRNAs可能成为一种非侵入性的分子靶标显示是否为结肠癌。

直肠癌；QPCR；miRNA；相关性

miRNA即微小RNA也称microRNA,是长度约19～25个核苷酸的高度保守的小片段非编码RNA,能够与靶mRNA的3'非转录区碱基不完全或完全配对,并在转录后水平通过降解靶mRNA或抑制翻译过程而发挥负调控基因表达的过程,与细胞的分化、增殖、凋亡密切相关［1-2］。直肠癌是我国危害极大的恶性肿瘤之一,发病率高且呈现出居高不下的趋势。有研究表明,microRNA对直肠癌疾病的发生起着重要的影响［3-4］。而调查结果显示,社区居民的结直肠癌知识水平偏低,当被告知有危险时的结直肠癌筛查意愿及参与自费结直肠癌筛查的意愿与其知识水平呈正相关［5］。本研究分析在正常与直肠癌组织中的具有表达差异不同miRNA,分析筛选出 miRNA与直肠癌临床病理参数的关系,以期为肠癌肿瘤诊断和预后评价标志物提供依据。

1 资料与方法

1.1 资料 芯片在广州复能基因有限公司检测,检测试剂盒购自广州复能基因有限公司。

1.2 方法 芯片检测 本研究收集来源于2012年9月～013年9月广州医科大学附属第三医院胃肠外科直肠癌切除手术患者20例。取未发生转移的原位直肠癌组织和癌旁组织作为标本。患者术前均未接受化疗放疗及其他针对肿瘤的特殊治疗,术后病理诊断证实为直肠癌,术中切除原发灶后即刻取癌组织。取材部位边缘相距至少2 cm。收集均征得患者本人的知情同意,其中男9例,女11例。临床病理分期诊断分为Ⅰ～Ⅳ期。其中Ⅰ期患者1例,Ⅱ期患者11例,Ⅲ期患者7例,Ⅳ期患者2例。本研究检测了 CEA(carcino-embryonic antigen)、CA199(Carbohydrate Atigen 19-9)、VEGF(vascular endothelial growth factor)、CK20(Cytokeratin 20)、p53(一种肿瘤抑制基因)、CDX2(caudal-relatedhomeodomain transcription 2)、vilin(检测淋巴结是否转移)等指标。

癌组织与癌旁组织RNA抽提使用Trizol常规方法,采用琼脂糖凝胶电泳判断RNA完整性,根据A260/A280判断RNA纯度,只有28S/18S≥2.0且A260/A280为1.9～2.1者才用于之后的实验。miRNA的cDNA合成采用特异性颈环引物,反转录相关操作按照试剂盒说明书操作。Real-time PCR严格按试剂盒操作说明进行,PCR反应条件:95℃变性10min,95℃变性15 s,60℃退火和延伸60 s,共40个循环。采用U6做参考基因,计算相对表达量。 检测 20 例患者 CEA、CA199、VEGF、CK20、p53、CDX2、vilin、淋巴结检测是否转移等指标的数据。获得数据为反应结束后计算后的各反应管内的Ct值。miRNA表达水平采用相对定量方法,以fold chang=2-ΔΔCt表示每个miRNA的变化倍数,再将结果转化为对数形式,ΔCt=CtmiRNA-CtU6(以此表示相对表达量),ΔΔCt=ΔCt(肿瘤组)-ΔCt(对照组)。

1.3 统计学方法 应用dchip软件分析不同样本和不同miRNA之间的聚集性。实时荧光定量PCR检测结果采用SPSS 19.0软件分析,数据以“±s”表示,在差值数据符合正态分布下组间比较采用t检验;miRNA与临床指标间的相关分析采用Spearman秩相关分析。

2 结果

2.1 筛选的差异miRNA 根据12例直肠癌患者检测结果数据进行分析。在P＜0.05的条件下,共筛选出96个直肠癌特异性的血浆差异miRNA,其中29个miRNA在患者血浆中表达上调,67个miRNA在患者血浆中表达下调。进一步提高筛选条件,从96个基因中选择26个相对定量变化大于1.6倍且P＜0.01的条件的miRNA(见表1、表2)。其中15个miRNA在患者血浆中表达上调,11个miRNA在患者血浆中表达下调。配对t检验结果表明,26个 miRNA中,has-miRNA1,has-miRNA145,has-miRNA4799-5p,has-miRNA-4790-5p在2组间的差异较大,has-miRNA182,22*的2组倍数变化较小。说明这些miRNAs有可能成为诊断的分子靶标。

表1 15个相对表达量上调的miRNATab.1 15 miRNAs that expression up-regulate relatively

表2 11个相对表达量下调的miRNATab.2 11 miRNAs that expression down-regulate relatively

2.2 聚类分析结果 采用dchip软件进行聚类分析,聚类分析的结果表明,microRNAs可以分为3大类,hsa-miR-4510和hsa-miR-143、hsa-miR-99a,hsa-miR-99b,microRNA363 分别为一大类。hsa-miR-22*等其余11个基因的病理组织和正常组织的基因相对表达量变化相似。hsa-miR-143和hsa-miR-27b表达结果最相近。其余类同,见图1。同时,12名患者中,p29,p15,p30患者的基因相对表达量总体差异最小。所有个体距离较近,说明患者基因检测水平离散度很小。

图1 个体结肠组织中microRNAs的聚类图Fig.1 Cluster ofmicroRNAs in calon tissure

2.3 相关性分析 细胞角蛋白20简称CK20,已有研究表明CK20 mRNA的表达与淋巴转移相关［13］。相关分析表明,CK20指标和 miRNA4770、miRNA4700-5p呈高度负相关(见表3)。

表3 CK20与部分微小RNA的相关分析Tab.3 Analysis of correlation between CK20 and microRNAs

本研究发现,所有筛选的病例样本中所选基因均在癌组织中下调,同时超过50%VEGF,100%Villin呈双阳性,90%p53成双阳性/阴性。相关分析表明,p53和miRNA182、miRNA125a-5p和miRNA126呈高度正相关(见表4)。

表4 p53与部分miRNA的相关分析Tab.4 Analysis of correlation between p53 and microRNAs

miRNA9在肿瘤样本中高表达,在对应的患者中随着vilin增高表达下调,表明该基因作为疾病相关的癌基因和疾病的发生机制有关。miRNA143和kras之间存在相关关系,相关系数为-0.645 5,P值为0.031 9。

随着CK20增高基因表达下调表明miRNA100、miRNA125a-5p、miRNA125b、miRNA145、miRNA145*和癌细胞淋巴转移可能有关。可作为进一步诊断是否淋巴转移的依据。

3 讨论

由于miRNA在人类与靶基因的作用方式为不完全结合,对靶基因发挥负性调控作用,且分子只有22 nt左右,理论上miRNA的靶基因很多,准确预测特定的miRNA仍较困难.本实验应用芯片技术在直肠癌及正常直肠组织中筛选出表达上调或下调的miRNA,讨论了成对的肿瘤和正常直肠组织的基因表达与直肠癌的临床诊断的关系问题,这种技术通常是在临床设置,选择一小部分miRNA,在本研究中,通过实时定量PCR实验选择了96个miRNA作检测。

本文主要集中在比较正常组织的肿瘤,诊断潜力,通过相关miRNA的表达与肿瘤亚型或临床参数的相关关系来衡量［6-8］。在本研究中,共分析了12个直肠癌样品,在标识表达的26个miRNA中,miRNA1,miRNA145,miRNA4799-5p,miRNA-4790-5p在2组间的差异较大,miRNA182,22*在2组间差异较小。说明这些miRNAs有可能成为诊断的分子靶标。

miR-145在直肠癌中表达下调,miR-143的表达也下调,但这2个miRNAs的表达与其他临床变量均不相关。而miRNAlet-7b、miRNA125b、miRNA100、miRNA125a-5p、miRNA125b、miRNA145、miRNA145*可能通过抑制抑癌癌基因(s)的淋巴转移和其他有针对性的基因在直肠癌的进展中发挥作用。虽然miRNA-143和miRNA-145不涉及病情发展。

进 一 步 研 究 miRNA100、 miRNA125a-5p、 miRNA125b、miRNA145、miRNA145*和癌细胞淋巴转移的关系有着重要意义。miRNA9在肿瘤样本中高表达,在对应的患者中随着vilin基因增高表达下调,表明其作为疾病相关的癌基因可能和疾病的发生机制有关。CK20指标和miRNA4770、miRNA4700-5p呈高度负相关［9-10］。

本文筛选了直肠癌患者癌组织和正常组织具有差异表达的微小RNA(miRNA),并找出了部分基因与临床特征的相关关系,为进一步直肠癌肿瘤诊断和选择预后评价标志物提供依据。但其靶基因仍需要试验验证,miRNA在直肠癌中的作用机制尚待阐明。相信随着各方面研究的深入和技术的不断进步,miRNA将在直肠癌的早期有效诊治方面发挥重要作用。

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(编校:吴茜)

Aapplication of colorectal cancer QPCR data for screening differentially expressed genes and exp lore its association w ith clinical parameters

YANG Hong

(Department of Radiotherapy and Chemotherapy,Tangshan Workers Hospital of Hebei Province,Tangshan 063000,China)

Objective To research the differences of tiny RNA(miRNA)expression between rectal cancer tissue and normal rectal tissue and analyze its relationship with clinical indicators.To explore tiny RNA's diagnostic and prognostic value in colorectal cancer research.Methods 12 cases of patients with colorectal cancer were taken cancer tissue samples after surgery,using QPCR to detectmiRNA in colorectal cancer tissues and adjacent cancer tissues and then screening differences in miRNA expression.Through cluster analysis,and screened P＜0.001 formiRNA,discover clusters of genes;and further analysis of clinic pathological parameters in patientswith colorectal cancer,clinical stage,lymph nodemetastasis's relationship with miRNAs'screening.Results Multiples of＞1.6,P＜0.01 under this conditions initially screened 26 miRNAs expressed differentially in patients with colon cancer,Cluster Analysis P＜0.001,three categories of genetic screening and similarities between three groups with similar individuals.miRNA100,miRNA125a-5p,miRNA125b,miRNA145,miRNA145*have cancer relationship with lymph node metastasis.miRNA9 expression in the tumor sample was high,and in the patients corresponding increase with vilin while downregulated genes,indicating that this gene as oncogene related diseases has relationship disease mechanisms.CK20 indicators were highly negative correlated with miRNA4770,miRN A4700-5p.Conclusion miRNA1,miRNA145,miRNA4799-5p,miRNA-4790-5p and other miRNAs can be used as a diagnostic molecular targets to guide the diagnosis of colon cancer.miRNA100,miRNA145 such aswhethermiRNAs could become a non-invasivemolecular targetmolecularmarkers of colon prompt.

colorectal cancer;QPCR;miRNA;association

R735

A

1005-1678（2014)06-0062-04

杨宏，女，本科，副主任护师，研究方向：直肠癌的治疗，E-mail：yh900@sina.cn。