饲料用脂肪酶产生菌——黑曲霉G55高产菌株的选育

张 谦， 贾 佳， 林 智， 郭宏涛， 王剑英

（1.深圳技师学院科研办，广东深圳 518045；2.深圳市绿微康生物工程有限公司，广东深圳 518055）

脂肪酶是脂肪代谢的关键酶，它可将脂肪水解为游离脂肪酸、甘油和甘油单酯供动物吸收利用（刘德海等，2012）。研究表明，单胃动物自身能够分泌内源性脂肪酶，但幼龄动物和特殊时期的动物，因为消化机能不健全或内源性脂肪酶分泌不足，造成脂肪消化吸收率低，需要适当添加外源性脂肪酶等以补充其内源酶的不足，而提高动物存活率和生产性能（赵必和李学海，2014；翁晓辉等，2013）。

黑曲霉（Aspergillus niger）是一种重要的微生物，广泛应用于生物酶制造。工业育种技术的运用是提高菌种产量，降低发酵成本的重要手段之一。贺胜英等（2011）和朱琪等（2013）通过工业育种技术，对产脂肪酶黑曲霉实施诱变和选育获得优良菌株，提高菌株的产酶能力。本研究以脂肪酶产生菌Aspergillus niger G55为出发菌株，分别采用紫外线（UV）和亚硝基胍（NTG）单因子诱变和复合诱变的方法处理菌株，使影响产量的基因发生突变，提高菌株的产酶能力，通过自然分离使正向突变株得到显现，结合筛选最终获得稳定的高产脂肪酶菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 黑曲霉为深圳绿微康生物工程有限公司提供，该菌株现保藏于公司酶制剂研究中心，保藏号：Aspergillus niger G55。

1.1.2 试剂和仪器 主要试剂：豆粕粉、蔗糖、葡萄糖、玉米淀粉、琼脂等培养基所用试剂均为国产化学级试剂。亚硝基胍（NTG）购自sigma公司。

仪器：净化工作台（苏州净化设备厂）；检测用台式紫外灯（灯管为JLCT50330-10，深圳乔麟光电有限公司）；PHS-25型pH计（杭州科晓化工仪器设备有限公司）；Avanti J-30I高效离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）。

1.1.3 培养基 斜面培养基：NaNO33 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，蔗糖 30 g，琼脂 15 g，蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.0。

种子培养基：NaNO33 g， 葡萄糖30 g，NaH2PO40.5 g，K2SO40.1 g，蒸馏水定容至 1000 mL，pH 7.0。

发酵培养基：豆粕粉 40 g，NaNO310 g，葡萄糖 20 g， 玉米淀粉 10 g，NaH2PO42 g，K2SO40.2 g，CaCO35 g，蒸馏水定容至 1000 mL，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 菌株培养 斜面种子培养条件：将-80℃保藏的菌株或经分离的单菌落，用接种针取1环均匀涂布于斜面培养基表面，于30℃恒温静置培养3 d，制备成斜面种子，于3～5℃冰箱保存备用。

摇瓶种子培养条件：将斜面种子用接种针取1环接种于装有30 mL种子培养基的250 mL摇瓶，于30℃ 恒温220 r/min振荡培养20～32 h，见培养液浑浊，OD600值在0.24～0.5，得到摇瓶种子备用。

摇瓶发酵培养条件：将培养好的摇瓶种子液按照1%接种量装于有50 mL发酵培养基的500 mL摇瓶中，于30℃恒温220 r/min振荡培养 48 h，发酵液在 10000 r/min，4℃离心 10 min，取上清液检测脂肪酶活性。

1.2.2 诱变因子和诱变方法 自然分离方法：取斜面种子试管，加入5 mL无菌蒸馏水用接种针刮下表面孢子，转移到盛有玻璃珠瓶中振荡2 min形成单孢子悬液，孢子量约107个/mL，将该单孢子液稀释，加入到20 mL斜面培养基的平皿中，控制菌落数为20～50个/皿，30℃静置培养3 d，进行摇瓶发酵，测定每一个菌落产脂肪酶活性。

UV诱变方法：取斜面种子制备成单孢子悬液，孢子量约107个/mL，取2 mL单孢子悬液于平皿中，在波长254 nm，功率10 W紫外灯下，照射距离20 cm，照射时间0～25 s，照射时将平皿往复振荡，照射后的平皿用黑布包裹并在暗环境下稀释分离，涂布平皿培养，培养方法同自然分离方法。

NTG诱变方法：取斜面种子以pH 6.0磷酸缓冲液制备单孢子悬液，孢子量约107个/mL，取1 mL单孢子悬液于20 mL试管，加入3 mL的NTG溶液（最终浓度为1×10-6mmol/mL）充分混合，于30℃恒温水浴振荡处理0～60 min，将诱变后的菌悬液在10000 r/min，4℃离心10 min，用无菌生理盐水洗涤终止反应，并进行稀释分离，涂布平皿培养，培养方法同自然分离方法。

UV+NTG诱变方法：取斜面种子制备成单孢子悬液，孢子量约107个/mL，取2 mL单孢子悬液于平皿中，在紫外灯下照射15 s，取1 mL孢子液于20 mL试管中，加入3 mL的NTG溶液（最终浓度为1×10-6mmol/mL），充分混合，于30℃恒温水浴振荡处理0～60 min，诱变后的菌悬液处理方法同NTG诱变方法，培养方法同自然分离方法。

1.2.3 筛选方法 菌株经过自然分离和不同诱变处理后分离得到的正常菌落直径为1.5～2 mm，呈白色，边缘整齐。观察菌落形态，根据异常菌落和正常菌落的比值计算菌落变异率；用消毒牙签取少许菌体接种于鉴别培养基平皿，根据菌落所形成的荧光圈大小，判断该菌落产脂肪酶活性，实施菌落的初筛。对于初筛得到的高产菌落转接斜面培养并进行3批复筛，每一批复筛做3瓶平行，测定菌株的产脂肪酶活性。

1.2.4 斜面传代试验 将经过筛选得到的高产脂肪酶菌株的斜面种子连续传接5代，实施摇瓶发酵，测定菌株经过传代后的产脂肪酶活力，考察菌株的遗传稳定性。

1.2.5 脂肪酶活性测定 初筛检测方法：在斜面培养基中添加1.2 g/L三丁酸甘油脂和显色剂罗丹明B（Rhodamine B,Sigma）构成固体鉴别培养基，产脂肪酶的菌落在该培养基上可以形成浅黄色荧光圈，并判断菌落的产脂肪酶活性（Kouker等1987）。

复筛检测方法：以碱滴定法测定发酵液中脂肪酶活性。脂肪酶活性单位定义为：在一定温度和pH条件下，每分钟释放出1μmol脂肪酸的酶量，定义为1 个酶活性单位，以 U/g（U/mL）表示（Tian 等 2013）。

2 结果及分析

2.1 诱变及筛选效果评价

2.1.1 UV诱变及筛选 当UV照射微生物细胞时DNA大量吸收260nm光谱而引起突变或杀伤作用 （施巧琴和武松刚，2003）。以脂肪酶产生菌Aspergillus niger G55为出发菌株，用UV照射0～25 s，稀释分离，在平皿中培养得到单菌落。以未经UV照射的G55菌株为对照，计算每个UV照射时间点的死亡率和菌落变异率，结果见图1。从经过UV照射的菌株中挑选出931株单菌落进行初筛，确定了产酶活性高出对照菌株5%以上的菌落共92株，接种斜面实施复筛，经过3批复筛，得到5个产脂肪酶活性稳定高于G55菌株的菌株，结果见表1和表2。

图1 UV对于G55菌株的诱变效果

表1 G55经UV诱变的初筛结果

表2 G55与复筛菌株产脂肪酶活性比较

由图1可见，G55菌株不实施UV照射的对照组，菌落自然变异率为2.1%。照射10～15 s时为亚致死量的照射时间，菌株死亡率为69.5%～74.7%，变异率为5.6%～7.8%。当照射时间为20～25 s时，菌株死亡率96.6%～99.8%，变异率显著提高。

由表1可见，经过初筛进入复筛的菌落大多集中在UV照射10、15、20 s的3个组中，出现正变菌株较多，复筛过程绝大多数菌株没有表现出稳定的高产特性，产脂肪酶活性退化。由表2可见，通过复筛的5个菌株以uv41最佳，UV照射时间为5 s，产脂肪酶活性为1948 U/mL，高于G55菌株6.7%。对此菌株进行了2次分离纯化得到uv41（s）。

2.1.2 NTG诱变及筛选 NTG是一种烷化剂，可以诱发并取代DNA分子中活泼的氢原子，直接与一个或者多个碱基起烷基化作用，从而改变DNA分子结构，引发突变 （施巧琴等，2003）。以Aspergillus niger uv41（s）为新的出发菌株，用 NTG诱变处理（最终浓度为1×10-6mmol/mL），经过稀释分离，在平皿中培养得到单菌落，诱变效果见图2。从NTG诱变菌株中，挑选出1085个单菌落实施初筛，从中挑选112株接种斜面实施复筛，经过3批复筛，得到8个产脂肪酶活性稳定高于uv41（s）菌株的菌株，结果见表3和表4。

图2 NTG对于uv41（s）菌株的诱变效果

表3 uv41（s）经NTG诱变的初筛结果

表4 uv41（s）与复筛菌株产脂肪酶活性比较

由图2可见，uv41（s）菌株不实施诱变的对照组，菌落自然变异率为2.7%。NTG诱变10～40 min时为亚致死诱变时间，死亡率为20.1%～45.4%；诱变50 min时，死亡率显著提高，变异率仅为13.3%；当诱变60 min以上时，菌株死亡率为82.2%，变异率接近24.7%。

由表3可见，经过初筛进入复筛的菌落大多集中在NTG诱变20、30、50 min 3个组中，出现正变菌株的几率比较高，进行复筛的110株，绝大多数菌株出现产脂肪酶活性退化。由表4可见，通过复筛的8株菌中以ntg349最佳，NTG诱变时间为30 min时，产脂肪酶活性为2323 U/mL，高于uv41（s）菌株15.7%。对此菌株进行了2次分离纯化得到 ntg349（s）。

2.1.3 UV+NTG复合诱变及筛选 不同诱变剂可以诱发菌株DNA发生不同形式的改变和变异，在微生物育种过程中通过有目的的选择两种或者两种以上的诱变剂，实施复合诱变，可以实现DNA分子的多重变异和叠加效用，提高菌株对诱变剂的敏感性，获得更好的育种效果 （施巧琴和武松刚，2003）。 以 Aspergillus niger ntg349（s）为出发菌株，采用UV+NTG复合诱变，首先用UV诱变，照射时间为15 s，然后，将孢子液加入到NTG溶液（最终浓度为1×10-6mmol/mL）中，诱变时间0～60 min，经过稀释分离，在平皿中培养得到单菌落，UV+NTG复合诱变效果评价见表5。挑选出1152株单菌落实施初筛，从中挑选118株接种斜面进行复筛，经过3批复筛，有11个菌株的产酶活性稳定高于ntg349（s）菌株，结果见表6和表 7。

表5 UV+NTG对于ntg349（s）菌株的诱变效果

表6 ntg349（s）经UV+NTG诱变的初筛结果

由表5可见，单独使用UV照射ntg349（s）15 min时，菌株死亡率为67.2%，变异率为9.4%，与G55对UV的耐受程度相近。采用UV复合NTG诱变时，表现出较高的死亡率和变异率，随着复合诱变剂量加大，菌株死亡率在90%以上，变异率在30%以上。

表 7 ntg349（s）与复筛菌株产脂肪酶活性比较

由表6可见，经过初筛进入复筛的菌落在UV+NTG诱变的3、4、5组和8组出现正变菌株的几率比较高，有118株进行了复筛。由表7可见，通过复筛所得到的11株高产菌株中以uan783最佳，菌株诱变剂量为UV 15 s+NTG 40 min（最终浓度为 1×10-6mmol/mL），产脂肪酶活性为 2470 U/mL，高于ntg349（s）菌株7.5%。对此菌株分别进行了3次分离纯化，得到 uan783（s）。

2.2 菌株的遗传稳定性研究

2.2.1 G55菌株系谱 脂肪酶产生菌Aspergillus niger G55为出发菌株，针对于UV和NTG单因素诱变和复合诱变获得的8个菌株的系谱如图3所示。

2.2.2 菌株的斜面传代产脂肪酶活性比较 分别对于脂肪酶产生菌Aspergillus niger G55和筛选得到的8个菌株的斜面种子进行连续传接5代，考察斜面孢子生长情况和产脂肪酶活性。由表8可知，对于筛选得到的菌株连续5次传代，所试验的9株菌传代斜面生长正常，表面产孢子丰富，经过多次诱变最终获得 uan370（s）和 uan783（s）菌株， 产脂肪酶活力分别为 （2435±62.7）U/mL和（2511±69.4）U/mL，CV 值分别为 2.6%和2.8%，说明该菌株传代稳定，具有良好的遗传稳定性和高产脂肪酶特性。

3 结论

综上所述，通过对脂肪酶产生菌Aspergillusniger G55分别采用UV和NTG单因子诱变和复合诱变，结合筛选最终获得稳定的高产脂肪酶菌株 uan783（s）和 uan370（s），产脂肪酶活力分别为2486 U/mL和2410 U/mL，相比原始出发菌种G55产脂肪酶活力提高32.1%和36.3%。同时，通过传代试验，证明获得的菌株具有高产酶活性和遗传稳定性。

图3 Aspergillus niger G55菌株系谱