动态浊度法测定人参多糖注射液中细菌内毒素的含量

张 娟，祝清芬，范治云

(山东省食品药品检验所，山东济南250101)

人参多糖注射液是从人参中提取出来的免疫增强剂，主要成分是人参多糖，人参多糖能刺激机体的体液免疫和细胞免疫功能，对S－180、ESA和u－14等动物移植肿瘤均有明显的抑制作用，增强患者的自身免疫力、提高放化疗期间的生存质量，且能降低环磷酰胺对骨髓和免疫功能的抑制作用。对肿瘤的放射治疗具有辅助作用［1～3］。其在临床应用广泛，用量较大。中药的安全性问题直接影响中医临床疗效，为确保患者的用药安全和医疗安全，细菌内毒素检查法是控制药物注射剂的重要的安全性指标［4］。本研究通过动态浊度法定量检测人参多糖注射液细菌内毒素含量，建立人参多糖注射液中细菌内毒素定量分析的方法。

1 实验材料

1.1 试剂与试药 人参多糖注射液(国内一企业生产，批号:20111205、20111206、20111207，规格:4 mL∶12 mg);细菌内毒素工作标准品(中国食品药品检定研究院，批号:150601－201174，160 EU/支);细菌内毒素检查用水(BET水，湛江安度斯生物有限公司，批号:1209030，5 mL/支);动态浊度法鲎试剂(湛江安度斯生物有限公司，批号:1301212，可测内毒素范围0.01 ～10 EU·mL－1，规格 1.25 mL，有效期2015/12)。

1.2 仪器 BET－48G细菌内毒素测定仪，天大天发科技有限公司生产;ZH－2型自动漩涡混合器，天津药典标准仪器厂;试验用试管、刻度吸管等玻璃器材按规定清洗，250℃干烤1 h除去外源性内毒素。

2 方法与结果［5，6］

2.1 细菌内毒素检查法限值(L)的计算 按《中国药典》2010年版(一部)附录ⅩⅢD细菌内毒素检查法项下，内毒素限值的确定的要求，一般按以下公式确定:L=K/M，式中L为供试品的细菌内毒素限值。注射剂K=5 EU·kg－1·h－1。根据人参多糖注射液说明书，本品静脉滴注，一次8 mL(2支)，一日1次。或遵医嘱。加入100～250 mL氯化钠注射液中静脉滴注。成人体重以60 kg计，可得M为0.4 mg·kg－1·h－1，即 L 为 12.5 EU·mg－1。因为此药用于减轻肿瘤放、化疗引起的副作用，亦可作为肿瘤治疗的辅助用药，为保障安全用药，对于抗感染、抗肿瘤、治疗心血管疾病等重症用的药品，可根据计算值适当调整，严格至计算限值的1/2或1/3。本品的限值设为每1 mg半乳糖醛酸中含内毒素应小于6 EU。

2.2 细菌内毒素标准曲线的建立和可靠性分析设定标准曲线各点浓度为2.0、0.5、0.125、0.031 25 EU·mL－1。用BET水将细菌内毒素标准品进行稀释，使其最终细菌内毒素浓度分别为 2.0、0.5、0.125、0.031 25 EU·mL－1，各取 0.1 mL，分别加到预先加有0.1 mL鲎试剂的反应管内，混合均匀，插入BET－48G型细菌内毒素检测仪内进行检测，每一浓度重复3管，同时做阴性对照(NC)。以平均反应时间的对数(lgT)为纵坐标，内毒素浓度的对数(LgC)为横坐标，绘制标准曲线。标准曲线回归方程为LgT=－0.236 9 LgC+2.812 3，相关系数r=－0.998 9(绝对值应大于0.980)，平行管之间的RSD均小于10%，阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间，细菌内毒素标准曲线成立，结果见表1。

表1 细菌内毒素标准曲线及可靠性分析(n=3)

2.3 供试品最大可稀释倍数的确定 本品细菌内毒素限值(L)为6 EU·mg－1，标准曲线最低浓度(λ1)为 0.031 25 EU·mL－1，供试品的 MVD=CL/λ1=(3 mg·mL－1×6 EU·mg－1)/0.031 25 EU·mL－1=576倍。

2.4 干扰试验 根据标准曲线内毒素浓度的设置，选择 0.25 EU·mL－1作为 λm。选择批号为20111205的人参多糖注射液，用BET水将供试品分别稀释为 18、36、72、144倍，作为供试品溶液(A液)，同时制备含上述供试品浓度并含内毒素浓度为λm(0.25 EU·mL－1)的溶液(B液)，分别取上述各液0.1 mL，加到预先加有0.1 mL鲎试剂的反应管内，混合均匀，插入仪器内进行测定，每个浓度重复2管。测定结束后，按标准曲线回归方程分别计算出供试品溶液和含标准内毒素λm的供试品溶液的内毒素含量，并计算该试验条件下的回收率(R)。

稀释36倍及以下时，回收率均在50～200%，符合要求，因此建议采用36倍以上的稀释液进行试验。

另取批号为20111206、20111207两批样品，分别制备36倍供试品稀释液(A液)和含相同供试品浓度且含内毒素浓度λm(0.25 EU·mL－1)的溶液(B液)，依法检查，B液回收率均在50% ～200%，符合要求，结果见表2。

表2 供试品干扰试验及供试品细菌内毒素测定(n=2)

2.5 供试品定量检查 供试品检查同“2.4”项下方法，根据标准曲线计算样品的内毒素含量，3批样品的内毒素含量均符合规定，结果见表2。

3 讨论

细菌内毒素检查法是利用鲎试剂来检测或量化革兰阴性菌产生的内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。随着鲎试验方法的测定仪器的不断完善，内毒素测定已向微量定量方向发展。动态浊度法是最常用的定量测定方法之一，通过测定反应溶液达到规定浊度所需时间或测定溶液自身的浊度变化率定量测定样品中内毒素含量。其克服了凝胶法检验结果只能判断产品的内毒素含量是否超标，而无法给出准确的含量的不足，具有操作简便、结果准确、检测灵敏度高、减少人为误差，帮助分析干扰情况和可以观察反应过程等优点［7］。定量测定在常规药品检查、生产过程质控、各种除热原方法的评价、特殊样品的检查(如血液、尿液、脑脊液)等方面。动态浊度法有快速、大范围定量的特性，使干扰实验在一两次实验后完成，节约成本，更适合于成分复杂，干扰大的中药注射剂的内毒素检测。

中药多糖注射液因其疗效显著在临床上得到越来越多的应用，但是与一般小分子中药注射剂不同的是，大分子的中药多糖注射液由于结构的复杂性使其在质量控制和安全性等方面存在着较大的风险［8］。不合格的供试品在临床应用时可能产生热原反应而造成严重的不良后果。我国药典规定，静脉用注射剂，应设细菌内毒素(或热原)检查项［5］。

本文采用动态浊度法对人参多糖注射液中细菌内毒素进行了检测，试验结果表明，样品经36倍稀释时即对试验无干扰作用，3批样品检查结果符合规定。因此，用动态浊度法来检测人参多糖注射液中细菌内毒素含量的方法是可行的。

［1］莫小为，徐萌，路安惠，等.不合理使用人参多糖注射液分析［J］.中国医院药学杂志，2009，29(12):1043－1044.

［2］冯青.人参多糖注射液配合化疗治疗晚期非小细胞肺癌80 例［J］.陕西中医，2009，30(12):1572.

［3］郑兴斌.人参多糖注射液在直肠癌患者化疗中的作用研究［J］.中国药房，2009，20(18):1425 －1427.

［4］蔡彤，张国来，李波，等.84种注射用药品细菌内毒素检查法的方法学研究［J］.中国药学杂志，2010，45(2):150－155.

［5］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(一部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:附录88，附录131.

［6］中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范(2010年版)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:310－325.

［7］王莉蓓，陈华龙，姜丽君.动态浊度法定量检测血栓通注射液中细菌内毒素［J］.齐鲁药事，2011，30(1):27－28.

［8］万琴，箫伟，王振中，等.市售不同厂家人参多糖注射液的质量评价［J］.中国中药杂志，2013，38(5):683－685.