贵州桐梓何首乌rDNA ITS序列分析

许 朋，牛宪立，姬可平

(遵义医学院珠海校区，广东 珠海519041)

何首乌(Polygonum multiflorum Thunb)为蓼科植物，分布于河南、四川、贵州、广东等地区。中草药何首乌的干燥块根部分，具有滋补肝肾、益精血、抗氧化、抗肿瘤、降低胆固醇、抑制动脉粥样硬化、抑菌消炎及增强记忆等多种功效［1］，在临床上应用十分广泛。药用何首乌近缘种包括木藤蓼(Fallopia aubertii)，齿叶蓼((Fallopia denticulate)，毛脉蓼(Fallopia multiflora var.cilliinerve)等，这些近缘种与何首乌不仅在外形上很相似，化学成分也有部分相同，在药材使用上存在互混、互代、以假充真等现象，因而影响了用药的安全性和有效性，常规方法很难把它们区分开，所以考虑寻找一种有效的能够区分何首乌及其近缘种的分子手段［2］，能够很好的在分子水平上鉴别何首乌。

核糖体rDNA内转录间隔区ITS作为一种遗传标记，具有可遗传性和可识别性，已经被广泛应用于中药材鉴定和品质评价、植物种质资源鉴定、与亲缘关系、系统发育等不同方面的研究。目前，越来越多的研究者将ITS应用于药用植物的鉴别。ITS序列在核基因组中具有高度重复性，总长度只有500～700 bp，具有通用引物，对DNA模板质量要求不高，因此即使不是新鲜材料，从DNA有降解的中药材上也可顺利进行扩增反应［3］。ITS在科属下使用较多，解决了一些种属间的关系，还发现ITS在居群间甚至个体间均有变异存在。

近年来，DNA分析技术的发展，PCR测序方法已经被广泛应用到中药品种鉴别领域［4－5］。本研究通过采用PCR技术对ITS序列进行扩增测序后运用MEGA5软件分析比对，并进行遗传距离分析、构建系统发育树来比较研究何首乌与其近缘种的遗传差异，为探讨何首乌的系统发育关系和分子鉴定提供分子生物学依据和基础性资料［6］，对中药材DNA分子鉴别和野生资源品种的鉴定等具有一定的意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 实验样品

所用实验材料何首乌于2011年4月采集于贵州桐梓地区，均由牛宪立老师提供。

1.1.2 主要实验试剂

(1)70%乙醇:量取70 ml的无水乙醇，30 ml双蒸水，混匀。

(2)3 mol/L NaAc溶液:称取无水乙酸钠24.589 g，先加入双蒸水80 ml加热溶解，再加双蒸水定容至100 ml，121℃灭菌20 min，4℃保存。

(3)0.5 mol/L EDTA(pH=8.0):称取 EDTA－2Na －2H2O18.8 g，加入双蒸水75 ml，用 NaOH 调pH 至8.0，加双蒸水定容至100 ml。

(4)0.5 mol/L Tris－HCl(pH=8.0):称取 Tris 30.27 g，加入双蒸水 350 ml，用 HCl调 pH 至 8.0，再加双蒸水定容至500 ml。

(5)TE 液:量取0.5 mol/L Tris－HCl(pH=8.0)4 ml，0.5 mol/L(pH=8.0)EDTA(乙二胺四乙酸)0.4 ml，加入双蒸水定容至200 ml，分别装至3个干净小瓶中，121℃灭菌15min，4℃保存。

(6)CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液:称取 CTAB10 g，加 70 ml双蒸水溶解，再取0.5 mol/L Tris－ HCl(pH=8.0)40 ml，0.5 mol/L EDTA(pH=8.0)8 ml，5 mol/L NaCl 56 ml，加双蒸水定容到200 ml，室温下保存，使用前先加入0.2%的β－巯基乙醇。

(7)5xTBE溶液:称取Tris(三羟甲基氨基甲烷)16.3 g，硼酸 8.28 g，0.5 mol/L EDTA(pH=8.0)6 ml，加双蒸水至300 ml，室温下保存，临用时稀释10倍。

(8)氯仿∶异戊醇(24∶1):量取192 ml氯仿，8 ml异戊醇，混匀。

(9)苯酚:氯仿:异戊醇(25∶24∶1):量取 100 ml的苯酚，100 ml氯仿:异戊醇(24∶1)，混匀。

(10)随机引物、PfuDNA聚合酶、β－巯基乙醇、dNTP、MgCL2。

1.1.3 实验仪器

本实验过程中应用到以下仪器 HH－W21.C600电热恒温水温箱(北京长源实验设备厂)5810R型冷冻高速离心机，WFH－202B紫外透射分析仪(上海精科实业有限公司)，Hema－8000型PCR仪(珠海黑马仪器厂)岛津 UV－2550型紫外分光光度计(日本岛津公司)，DYC型电泳仪(北京六一仪器厂)

1.2 方法与步骤

1.2.1 DNA 提取(改良 CTAB 法)

(1)取何首乌干叶片200 mg，剪成小碎片放置于冷研钵中，用液氮迅速研成粉状(越细越好)，将粉状物转入至预冷的1.5 ml干净离心管中，加入600 μl预热的CTAB DNA提取缓冲液，充分摇匀，65℃水浴1 h，在水浴过程中每10 min温和颠倒混匀1次。

(2)取出离心管，使之恢复室温，加入等体积酚－氯仿－异戊醇(25∶24∶1)轻缓颠倒混匀，室温下12 000 r/min离心 10 min。

(3)取上清转移至另一新的1.5 ml离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)轻轻颠倒混匀后9 000 rpm离心15 min。

(4)吸取上清液于另一新的1.5 ml离心管中，加入1/5体积的5 mol/L NaCl溶液，2/3倍体积冷异丙醇，轻轻颠倒混匀，4℃静置 30 min后，11 000 rpm/min，离心10 min，弃去上清液，用70%乙醇洗涤2－3次，室温吹干。

(5)将 DNA 溶于500 μl TE，加入5 μl RNA 酶，37℃恒温水浴箱保温1 h以裂解RNA。

(6)加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)轻缓颠倒混匀，室温下10 000 r/min离心10 min。

(7)取上清转移至另一新的1.5 ml离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)轻轻颠倒混匀后6 000 rpm离心15 min。

(8)上清液移入新的离心管中，加入1/10体积的3 mol/L NaAc(pH=5.2)溶液，混匀后加入2倍体积的冰冷的无水乙醇，颠倒混匀，4℃静置20 min后，11 000 rpm/min，离心 10 min。

(9)倒掉液相，用70%乙醇冲洗2～3次后，在室温下自然风干，加入适量的TE缓冲液溶解DNA，分装后放入4℃待用。

1.2.2 DNA纯度及片段大小的检测

DNA样品稀释200倍后，在UV－2550紫外分光光度仪上测定其在260 nm、280 nm处吸光度值，根据OD260、OD260/OD280值来判断DNA的浓度和纯度。

DNA浓度计算公式:DNA浓度(μg/ml)=OD260×稀释倍数×50

运用1%琼脂糖凝胶进行电泳，检测样品DNA片段的大小，观察并且拍照。

1.2.3 电泳－琼脂糖凝胶板配制方法

制备1%的琼脂糖凝胶(50 ml):称取0.5 g琼脂糖于干净锥形瓶中，再加入50 ml的0.5×TBE。酒精灯加热煮沸至琼脂糖全部融化，即得1%琼脂糖凝胶液［7］。取电泳槽内的有机玻璃内槽洗干净并晾干模子。将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液中加入0.5 μl的核酸染色剂 Goldview，轻轻混匀。小心地倒入有机玻璃板上，使胶液缓缓展开，一直到整个玻璃板的表面形成均匀的胶层。室温下静置直到凝胶完全凝固，垂直轻轻拔掉梳子，取下胶带，将凝胶以及内槽放入电泳槽中。添加0.5×TBE电泳缓冲液至没过胶板为止。取1 μl上样缓冲液与DNA样品混合［7］。用10 μl微量移液枪分别将Marker和样品加入胶板的样品槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。加样后的凝胶板立即通电进行电泳，正确连接电泳槽和电源，红色线连接阳极，黑色线连接阴极，电压80 V，样品由负极(黑色)向正极(红色)的方向移动，当溴酚蓝移动到距胶板下沿大约1 cm处时，停止电泳［8］。在紫外灯下观察，DNA存在则有红色荧光条带显示，采用凝胶成像系统拍照并保存。

1.2.4 ITS 扩增和测序

参考White等［9］设计一对通用引物，用于扩增ITS1－5.8S－ITS2完整序列，P1(5’－CGAAG TAAAAGTCGTAACAAGG －3’)位于18 S上，P2(5’－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3’)位于26 S上，由上海生工生物工程技术有限公司合成。采用P1和P2双引物整段扩增，在50 μL反应体系中，含基因组 DNA1 μL、引物各 1 μL、PfuDNA 聚合酶 2.5U、dNTPs 0.1 mmol·L－1、Mg2+1.5 mmol·L－1。反应条件:PCR扩增条件为94℃预变性5 min，94℃变性2 min，52℃退火3 min，72℃延伸2 min，循环30次;72℃延伸10 min，反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳初步鉴定后，分别送交上海生工和上海英骏广州分公司做双向测序。

1.2.5 序列分析

经公司测序的结果进行手工校正，采用MEGA5软件进行序列比对分析和遗传距离分析，并用MEGA5软件绘制NJ系统树。

2 结果分析

2.1 DNA 浓度

紫外分光光度计检测何首乌DNA浓度，DNA的OD260/OD280比值为1.714，何首乌 DNA浓度为480 μg/ml。

2.2 PCR扩增产物电泳检测

何首乌样品经改良CTAB法提取总DNA，PCR扩增产物(见图1)，图谱中样品条带清晰，达到实验要求，可以用来测序。由图知贵州桐梓何首乌样品ITS序列的长度在500 bp到750 bp之间。

2.3 测序结果及序列分析

经测序得到何首乌rDNA ITS序列，对测序结果比对发现何首乌rDNA的ITS序列，4种何首乌近缘种ITS序列均来源于Genbank，根据Genbank已报道的近缘种(Genbank登录号见表1)序列资料确定rDNA内转录区ITS1和ITS2与3个编码区18 S、5.8 S、26 S的界限。何首乌rDNA完全序列片段长度共约652 bp，其中ITS1的长度为202 bp，G+C含量为70.29%，5.8 S的长度为 161 bp，ITS2长度为232 bp，G+C含量为68.97%，何首乌 ITS序列与GenBank中近缘种序列之间的遗传距离见表2，其中遗传距离范围为0.077 0～0.421 1。图2是贵州桐梓何首乌与GenBank中4种近缘种ITS序列系统发生树，通过NJ树可以看出，何首乌单独为一支，说明何首乌与其近缘种的ITS序列存在较大变异。

图1 ITS序列PCR扩增产物电泳图谱Fig.1 gel electrophoresis profiles of PCR amplification products of ITS sequence

经测序得贵州桐梓何首乌rDNA ITS序列依次为:

表1 何首乌近缘种序列来源Table1 Polygonum multiflorum relative sequence source

表2 何首乌与其近缘种遗传距离Table 2 polygonum multiflorum from different regions of genetic distance

图2 何首乌及其近缘种rDNA ITS系统发育树Fig.2 Polygonum multiflorum Thunb and its relative rDNA ITS phylogenetic tree

3 结论与讨论

中药材用于疾病防治已有几千年的历史，但由于中药现代品质监控技术不足，常常出现药材混淆代用、故意伪制等现象，严重影响了临床用药的安全性，甚至危及人的生命，寻找健全完善的中药品质检测技术迫在眉睫。目前，越来越多的研究者将ITS应用于药用植物的鉴别，为揭示药用植物的遗传差异和鉴定中药材品种提供了科学依据。

rDNA ITS区段在科、属、种水平上均有特异性序列的特性，对ITS区进行PCR扩增、测序及序列对比分析后，设计特异性引物来检测真核生物的方法已越来越被广泛应用。ITS序列具有相对较快的进化速率，一般用于研究亲缘关系较近的属间关系以及种间甚至居群间的系统关系［10］。rDNA内转录间隔区ITS作为一种遗传标记，具有可遗传性和可识别性，ITS序列长度适中，人们可以从不太长的序列中获取足够信息，被广泛用于属内种间或种内群体的系统学研究［11－12］。ITS序列的DNA条形码鉴定研究日益受到中药研究工作者的广泛关注和实际应用［13－14］，ITS序列的进化速率较快、基因片段短、直观性强、扩增和测序容易，存在种内多态性，已成为中药现代化研究的一个重要方面，为揭示药用植物的遗传差异和鉴定中药材品种提供了科学依据［15－16］。

为了获取高质量的DNA，本实验采用改进的CTAB法对何首乌进行DNA的提取，CTAB是一种有效的阳离子去污剂，可溶解细胞膜，能与蛋白质和多聚糖形成复合物。本实验利用CTAB在高离子强度的缓冲溶液中与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物，但不沉淀核酸的特性，离心获得含DNA的上清液;用氯仿与异戊醇的混合溶液抽提DNA，去除蛋白质，使蛋白质变性、分层。在抽提过程中，混合使用酚和氯仿抽提效果最好。酚的变性抽提作用要比氯仿好，但酚和水有一定比例的互溶，氯仿的变性作用不如酚的效果好，但氯仿和水不相溶，不会除掉DNA，经酚第一次抽提后水相中有残留的酚，由于酚与氯仿互溶，用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚除去;用酚和氯仿抽提DNA时，还要加入少量的异戊醇，因为在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈震荡离心管数次，导致混合液中容易产生气泡，气泡会影响相互间的作用，加入异戊醇能降低分子表面张力，减少抽提过程中泡沫的产生，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。在沉淀DNA时，加入的Na+能中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而使DNA易于聚集沉淀，加入乙醇可以除去盐离子;加入RNase降解RNA，从而得到纯净的DNA分子，达到提取和纯化DNA的目的，从而获得了高质量的DNA，适合下一步的分子生物学的研究。

本研究通过对序列的比对分析，发现何首乌rDNA ITS序列与GenBank中已有的何首乌近缘种的ITS序列有明显的差异，说明何首乌与其近缘种间变异较大，通过NJ树可以将何首乌及其近缘种区分开来。实验结果表明对ITS序列的比对分析可用以鉴别种属之间的差异，同时为中药材鉴别研究提供了新思路;ITS序列可对何首乌及其近缘种做出鉴别，ITS区序列的差异能为鉴别何首乌提供依据。

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