一种适用于林地土壤微生物RAPD体系的建立1）

贾丹，刘玉龙，邵英男，张鑫炎

（1.黑龙江省森林工程与环境研究所，哈尔滨 150081；2.森林可持续经营与环境微生物工程黑龙江省重点实验室）

0 前言

目前，传统的、针对土壤微生物的研究，大都是基于培养分离的方法。随着人们对土壤中微生物的原位生存状态研究，越来越发现常规的分离培养方法很难全面地估价微生物群落多样性。从土壤中简单提取和平板培养计数不能得到土壤微生物在土壤生态系统中的生活特征和生态功能的信息。应用现代生物化学和分子生物学方法，成功克服了传统微生物生态学研究技术的局限性［1］。

与传统培养的方法相比较，分子标记具有许多明显的优越性，表现为：（1）直接以核酸作为研究对象，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，与发育时期无关，可用于植物基因型的早期选择；（2）标记数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎是无限的；（3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须专门创造特殊的遗传材料；（4）许多标记表现为共显性，能区别纯合基因型和杂合基因型，可提供完整的遗传信息［2］。

近年来发展起来的随机扩增的多态性DNA（RAPD，Random Amplified Polymorphic DNA）分子遗传标记技术以检测多态性DNA为目的，因快速、简便的特点，其在物种分类和亲缘关系鉴定、基因组分析等方面得到广泛应用，也可用于在DNA水平上反映微生物群落的多样［3-5］。

但是RAPD标记也有缺点，对反应条件极为敏感，稍有改变就会影响扩增产物的重现［6］，有时产生的多态性DNA电泳图谱比较复杂，给样品的检测和结果分析带来一定的困难。所以，为了实验的准确性，必须要对退火温度、Mg2＋浓度、Taq酶用量等条件进行优化，使其反应体系更加稳定、可靠［7-10］。

1 材料与方法

1.1 土壤材料

研究区域为穆棱县，在实验区范围内共取了3种林型，分别为椴树红松林、云冷杉红松林和蒙古栎红松林，分别在样地中取树木根际土壤，放入冰箱4℃冷藏保存。

1.2 土壤DNA样品

实验利用Mobio公司生产的强力土壤DNA提取试剂盒（Power SoilTMDNA Islation Kit）对所采集的土壤进行总DNA的提取。所得到的DNA样品浓度均在600～1000ng／μL。OD260／OD280均在1.8左右。然后经1%琼脂糖凝胶电泳检测发现，主带清晰且集中，没有散状的拖尾现象，胶孔没有蛋白质残留，胶底部未见RNA污染。故用此方法得到的基因组DNA可用于后续试验。

1.3 PCR产物的检测

取8μL PCR产物与6×加样缓冲液充分混合后，点入TAE为缓冲液的1%的琼脂糖凝胶中，同时点入DL2000Marker进行电泳，电泳结束后在凝胶成像系统中检测PCR结果。

2 结果与讨论

2.1 RAPD退火温度的优化

图1 退火温度的优化

退火是PCR反应中较为重要的一步，退火温度的选择也决定着PCR的成败。由于RAPD反应的退火温度较低，所以本试验对退火温度进行了优化。分别取35、36、37、38、39℃为退火温度对相同引物［11-12］、相同模板、统一条件下进行RAPD反应，得到的结果经琼脂糖凝胶电泳进行检测（见图1），退火温度与泳道1～5相对应（下同）。

由电泳图1中可见泳道1出现轻微的弥散的条带，无明显条带出现。泳道2出现了3～4条较暗的条带。泳道3至泳道5中均出现了较多的且明亮的特异性条带。其中泳道5中出现了较亮的几条特异性的条带，但条带数少于3、4泳道。3与4的条带数基本相同，但是泳道4中的条带特异性好于泳道3。这可能由于35℃与36℃下，温度过低造成两条变性链重新结合形成双链或者是温度低于最适退火温度，而造成扩增条带的不特异。而在39℃时，特异性提高，从而造成多态性降低。所以，选取38℃为退火温度。

2.2 Mg2＋浓度优化

Mg2＋的作用主要是dNTP-Mg2＋与核酸骨架相互作用并能影响聚合酶的活性，Mg2＋浓度对PCR扩增效率影响很大。本实验分别选取向20μL反应体系中加入0.8、1.0、1.2、1.4、1.6μL浓度为25mmol／L的MgCl2，统一条件下进行RAPD反应，得到的结果经琼脂糖凝胶电泳进行检测（见图2）。

图2 Mg2＋浓度的优化

由图2可知，泳道1中只有2条较暗的条带。泳道2～5中均得到了多态性较好的条带。其中泳道3中得到的条带最亮且多态性最好。这可能是由于泳道1中Mg2＋浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。而泳道5的Mg2＋浓度过高，抑制目的产物扩增。所以选取向20μL体系中1.2μL MgCl2。

2.3 Taq酶用量的优化

图3 Taq酶用量的优化

Taq DNA聚合酶是PCR反应中重要的组成部分，决定着PCR反应能否进行。本实验分别选取向20μL反应体系中加入0.15、0.2、0.25、0.30、0.35 μL规格为5U／μL的Taq DNA聚合酶。统一条件下进行RAPD反应，得到的结果经琼脂糖凝胶电泳进行检测（见图3）。

由图3可知，5个泳道中的扩增效果差异较小，其中泳道3中得到的多态性较丰富且条带较亮。故选择向20μL体系中0.25μL Taq DNA聚合酶。

3 结论

通过对RAPD反应体系中3个重要因素的优化实验，可以得到如下结论：1）退火温度对RAPD反应体系的影响较大，所以在进行RAPD实验时应首先对退火温度进行优化。本实验得到的最优退火温度为38℃。2）Mg2＋浓度对RAPD有一定的影响。3）Taq DNA聚合酶的用量对RAPD反应的影响较小。

利用上述优化实验最终建立适用于林地土壤微生物RAPD体系：在20μL PCR反应体系中加入10ng土 壤 微 生 物 DNA 模 板；1.2μL 浓 度 为25mmol／L的 MgCl2；1.25μL 浓度为2.0mmol／L的dNTP；0.8μL浓度为20mmol／L的随机引物；1.25U的 Taq DNA 聚合酶；2μL 10×PCR Buffer（Mg2＋Free）；无菌去离子水补足体积。

PCR扩增反应程序如下：94℃预变性5min，进如40个循环阶段，94℃变性1min，38℃退火1min，循环结束后72℃延伸2min。72℃延伸7min，4℃保存。

［1］ 张海涵，唐明，等.黄土高原5种造林树种菌根根际土壤微生物群落多样性研究［［J］.北京林业大学学报，2008，3（5）：85-90.

［2］ 贾继增.分子标记种质资源鉴定和分子标记育种［J］.中国农业科学，1996，29（4）：1-10.

［3］ 夏北成，ZhouJiZhong，James M.Tiedje.植被对土壤微生物群落结构的影响［J］.应用生态学报，1998，9（3）：296-300.

［4］ 陈灏，唐小树，林洁.不经培养的农田土壤微生物种群构成及系统分类的初步研究［J］.微生物学报，2002，42（4）：478-483.

［5］ 郑成木.植物分子标记原理与方法［M］.长沙：湖南科学技术出版社，2003：1.

［6］ 姜自锋，林乃栓，徐梅.RAPD技术及其应用中的一些问题［J］.福建农林大学学报（自然科学版），2002，31（3）：356-360.

［7］ Welsh J，McClelland M.Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers［J］.Nucleic Acids Res，1990，19：7213-7218.

［8］ Waugh R.Using RAPD markers for crop improvement.Tibtech，1992，10：186-191.

［9］ Williams J G K，Kubelik A R，Livak K J et al.DNA polymorphisms amplifies by arbitrary primers are useful as genetic markers［J］.Nucleic Acids Res，1990，18：6531-6535.

［10］ 姜自锋，林乃栓，徐梅.RAPD技术及其应用中的一些问题［J］.福建农林大学学报（自然科学版），2002，31（3）：356-360.

［11］ 曹立成.甜菜 M14品系分子标记的研究［D］.哈尔滨：黑龙江大学，2006.

［12］ 周延清.DNA分子标记技术在植物研究中的应用［M］.北京：化学工业出版社，2005：1.