重组海蚯蚓纤溶酶的克隆、表达及活性鉴定

鞠吉雨，于文静，初金鑫，张金宝，连 波，赵春玲*

1潍坊医学院基础医学院;2 潍坊医学院药学与生物科学学院，潍坊 261053

血栓性疾病严重威胁着人类健康，其主要治疗手段之一是溶栓。溶栓剂迄今已发展了三代，但出血、发热、过敏反应、低血压等副作用的出现使现有药物并不理想。临床上迫切需要寻找和开发安全高效的新型溶栓剂。研究发现，纤溶酶(fibrinolytic enzyme)在溶栓治疗中起重要作用，能够溶解血凝块的主要成分纤维蛋白［1，2］。

海蚯蚓(Arenicola cristata)，属于环节动物门海洋生物，始载于《中国药用动物志》，用于痈疮肿毒，有清热解毒之功效。但有关海蚯蚓的研究只有少量报道［3-5］。1975 年血红蛋白从海蚯蚓中被分离且结构被特征化;Parker 等从海蚯蚓中分离到4 种能够激活环AMP 磷酸二酯酶;Wang 等从海蚯蚓中分离到一种具有抗肿瘤活性的新的烯醇式磺化甾醇—Arenicolsterol A。本研究利用cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)法，从海蚯蚓消化道组织中获得海蚯蚓纤溶酶的cDNA 序列、氨基酸序列，构建原核表达载体并表达纯化融合蛋白，并进一步对其功能进行初步研究。本研究为探讨海蚯蚓纤溶酶的生物学活性和可能的开发应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

海蚯蚓采自烟台市近海。Trizol 试剂、3＇RACE试剂盒、5＇RACE 试剂盒购自北京吉百特公司;反转录试剂盒购自fermentas 公司;T-A Easy 试剂盒、高保真Taq 酶、内切酶BamHI 和XhoI 购自大连宝生物公司;IPTG、镍柱填料和超滤管购自北京东胜泰博公司;牛血纤维蛋白溶酶原和尿激酶购自中国食品药品检定研究院。表达载体pET-21a、E.coli BL21为本室保存。

1.2 海蚯蚓纤溶酶基因cDNA 3＇及5＇ 端序列扩增及测序

设计引物序列:3R 为含接头引物序列的反转录引物;3R1 为3＇端接头引物;3F1 是根据丝氨酸蛋白酶家族催化活性中心Ser 附近所含的高度保守序列GDSGGP 设计的引物。5R 为oligodT 反转录引物;5R1、5R2 是根据3＇RACE 获得的3＇端序列设计的特异性引物;5F1 为含5＇端接头引物序列的引物;5F2为5＇端接头引物。引物具体序列见Table 1。

利用Trizol 试剂从鲜活海蚯蚓肠道组织中提取总RNA，以3R 作为反转录引物使用fermentas 公司反转录试剂盒合成cDNA，以cDNA 为模板，3F1 和3R1 为上下游引物，利用3＇RACE 试剂盒扩增3＇末端序列。以5R-oligodT 作为反转录引物合成cDNA，使用dCTP 和TdT 对纯化的cDNA 加尾，以过柱纯化后的加尾产物为模板，5F1、5R1 和5F2、5R2 分别为引物，利用5＇RACE 试剂盒扩增5＇末端序列。将扩增出来3＇和5＇末端序列电泳胶回收纯化后，分别连接TA 克隆载体，转化细菌E.coli DH5α，测序。应用Contigexpress 软件对海蚯蚓纤溶酶基因cDNA 5＇端和3＇端序列进行拼接。

1.3 生物信息学分析

将得到的海蚯蚓纤溶酶基因DNA(mRNA)序列，使用DNAMAN 软件，获得该海蚯蚓纤溶酶cDNA 编码的氨基酸序列。登陆NCBI 利用Blast 在GenBank 数据库和蛋白质数据库进行同源性比较分析。Signal P 3.0 软件分析海蚯蚓纤溶酶的信号肽序列。

1.4 海蚯蚓纤溶酶基因重组表达载体的构建

根据发现的海蚯蚓纤溶酶基因cDNA序列，设计一对引物，F:5＇-TTCGAGCTCATTATTGGTGGTTCTGATGCA-3＇，R:5＇-GTGCTCGAGGACTCCAGTAACACTCTGGAT-3＇，上下游引物中分别引入Sac1 和XhoI 酶切位点(下划线部分);以海蚯蚓纤溶酶cDNA 为模板，利用pfu DNA 聚合酶扩增活性肽的cDNA 片段，PCR 产物利用酶切、连接的方法构建至原核表达载体pET-21a 中，并转化至E.coli DH5α 中，以双酶切和测序进行阳性克隆的筛选与鉴定。

1.5 重组海蚯蚓纤溶酶的诱导表达与纯化鉴定

提取经鉴定确认的阳性重组质粒，转化至E.coli BL21(DE3)，构建工程菌。工程菌单菌落在1.0 mM IPTG 中30 ℃诱导培养4 h(对照组未加入IPTG);收集菌体后超声破碎，4 ℃12000 × g 离心30 min，上清和沉淀各取10 μL 进行SDS-PAGE 分析。将收集的菌体超声破碎后，取上清液过Ni2+树脂柱，50 mL 洗涤液洗涤(20mM Tris-CL，pH7.4，10 mM 咪唑，0.5 M NaCl);用洗脱液(20 mM Tris-CL，pH7.4，500 mM 咪唑，0.5M NaCl)洗脱结合蛋白，每次加入1 mL，共洗5 次。

1.6 重组海蚯蚓纤溶酶的纤维蛋白酶原激活活性测定

在50 mL TBS-HCL(50 mmol/L Tris-CL，pH 8.0，150 mmol/L NaCl)缓冲液中加入0.5 g 琼脂糖，微波炉煮沸;加入0.5 g 脱脂奶粉，混匀。冷却至40℃后加入10 U 牛血纤维蛋白溶酶原，混匀。铺2 个平皿，待凝固后打孔，加入0.5、1 μg/μL 重组蛋白，以尿激酶(1 μg/μL)为阳性对照，以PBS 为阴性对照，37 ℃孵育16 h 后，观察小孔周围有无透明圈的形成。

2 实验结果

2.1 海蚯蚓纤溶酶基因cDNA 3＇端及5＇端序列扩增

以海蚯蚓消化组织RNA 为模板，利用3＇RACE和5＇RACE 技术分别扩增出3＇端及5＇端序列，琼脂糖凝胶电泳结果显示，3＇端和5＇端扩增产物长度分别约为250bp 及740bp(图1，图2)。测序后，应用Contigexpress 软件对海蚯蚓纤溶酶基因cDNA 5＇端和3＇端序列进行拼接，获得海蚯蚓纤溶酶编码基因的DNA(mRNA)序列。使用DNAMAN 软件，获得该海蚯蚓纤溶酶cDNA 编码的氨基酸序列。该蛋白酶由信号肽、前肽及成熟肽组成，成熟肽以IIGG 起始;含丝氨酸蛋白酶家族高度保守序列GDSGGP 及保守的催化三联体(H79，D126，S213)(图3)。

图2 5＇ RACE 扩增产物Fig.2 Amplification product of 5＇ RACE

2.2 海蚯蚓纤溶酶cDNA 编码的氨基酸序列的同源性分析

图3 海蚯蚓纤溶酶基因序列和氨基酸序列Fig.3 Gene sequence encoding fibrinolytic enzyme of A.cristata and deduced amino acid sequence

登陆NCBI，利用Blast 在GenBank 数据库和蛋白质数据库进行同源性比较分析。结果显示尚无与该基因具有明显相似性的序列，提示其可能为一新基因。该海蚯蚓纤溶酶与蚯蚓蛋白酶比较，氨基酸序列同源性为＜40%;海蚯蚓蛋白酶除与其他环节动物的蛋白酶都具有GDSGGP 高度保守序列外，在一级结构上没有同源性。

2.3 重组表达克隆的鉴定

筛选的阳性克隆经Sac1 和XhoI 双酶切，出现705bp 目的基因片断(图4)，经测序，序列与RACE克隆结果一致。

2.4 重组蛋白的表达纯化

将重组表达载体转化至E.coli BL21(DE3)，诱导表达后，结果如图5 所示，在27kDa 处可见有重组海蚯蚓纤溶酶融合蛋白，主要以包涵体形式存在，上清中含量较少。上清液经Ni2+树脂柱纯化后获得均质的融合蛋白(图6)。

2.5 重组海蚯蚓纤溶酶的纤维蛋白酶原激活活性

经平板法检测纯化的重组海蚯蚓纤溶酶的活性。在加入纤维蛋白酶原的平板上，加重组蛋白和尿激酶的小孔周围形成明显的透明圈(图7);而不加纤维蛋白酶原的平板上，加重组蛋白和尿激酶的小孔周围都没有透明圈形成。这说明该重组海蚯蚓纤溶酶具有纤维蛋白酶原激活活性。

图4 重组表达克隆的酶切鉴定Fig.4 Identification of the recombinant clone by restriction enzymes

图5 重组原核表达载体的诱导表达Fig.5 Induced expression of the recombinant plasmid from A.cristata protease

3 讨论

纤溶酶作为新型溶栓剂，主要来源于天然动植物、微生物［6-9］。但由于分离提取存在操作繁琐、提取纯度低、所需原材料多等缺点，因此，应用基因工程技术获得有功能性的蛋白药物已成为该领域的研究热点。纤溶酶大多属于丝氨酸蛋白酶家族，该家族的蛋白酶催化活性中心Ser 附近含高度保守序列GDSGGP［10］，这为寻找已知功能蛋白的编码基因提供了入手点。

图6 重组表达蛋白的纯化Fig.6 Purification of the recombinant protein

图7 重组表达蛋白的体外活性测定Fig.7 In vitro fibrinolytic activity of the purified recombinant protein

本研究根据丝氨酸蛋白酶家族高度保守序列GDSGGP 设计引物，采用3＇RACE 和5＇RACE 技术从海蚯蚓消化道上皮细胞中扩增出长度为777bp 的蛋白质编码序列。该基因序列与GenBank 数据库中的其他基因序列没有明显的相似性;其氨基酸序列在蛋白质数据库进行同源性搜索分析证明该基因为一新发现的基因，且其蛋白序列中含有与其他丝氨酸蛋白酶家族高度保守序列GDSGGP，这提示我们克隆到的海蚯蚓纤溶酶为丝氨酸蛋白酶家族的一个新成员。海蚯蚓纤溶酶中还含有保守的催化三联体(H83、D129、S225)，由信号肽、前肽及成熟肽组成，且其成熟肽即蛋白质的活性形式中含有保守的IVGG(第36～39 位)序列［11］。进一步将海蚯蚓成熟肽成功构建至原核表达载体pET-21a 中，转化工程菌，融合蛋白主要为包涵体，其上清经Ni2+树脂柱纯化后，通过平板法证明该融合蛋白具有纤维蛋白酶原激活活性，显示了间接的纤溶活性。丝氨酸蛋白酶家族主要裂解纤维蛋白和纤维蛋白原中Lys或Arg 羧基端的肽键使其被降解成许多具有抗凝作用的可溶性小肽［12］;有的纤溶酶还作为纤溶酶原激活剂，间接发挥溶栓作用，如葡激酶［13］、普佑克(注射用重组人尿激酶原，即Pro-UK)［14］。

另外，就形态而言，海蚯蚓形似蚯蚓，故名海蚯蚓;就种属而言，海蚯蚓与蚯蚓都属于环节动物门，海蚯蚓属于多毛纲，蚯蚓属于寡毛纲。从蚯蚓中提取的蚓激酶，具有良好的溶栓抗凝作用，使其在治疗多种血栓性疾病方面取得很好的应用［15］。蚓激酶(lumbrokinase，LK)就是从蚯蚓体内分离出的一组20～40 kDa 丝氨酸蛋白酶，也称蚯蚓纤溶酶(earthworm fibrinolytic enzyme，EFE)，具有直接溶解纤维蛋白及纤溶酶原激活作用［16-18］。

因此，我们推测:海洋生物海蚯蚓中也可能含有一组具有溶栓作用的纤溶酶。我们期望能继续进行海蚯蚓纤溶酶的克隆工作，并对克隆到的海蚯蚓纤溶酶的溶栓活性进行比较，为进一步发现高效低毒的具有溶栓作用的海洋创新药物提供科学依据。

总之，本研究从海洋环节生物海蚯蚓中克隆到海蚯蚓纤溶酶的cDNA 序列和氨基酸序列，并初步证明其具有纤维蛋白酶原激活活性。这为海蚯蚓功能基因组学和蛋白质组学研究奠定理论基础，也为开发海洋生物新型溶栓药物提供新的思路和资源。

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