海南不同产区铁皮石斛活性成分的比较研究

王 佳，陈海霞*，邢利沙，王艳伟，黄宇航，刘海青

1天津大学药物科学与技术学院 天津市现代药物传递及功能高效化重点实验室，天津 300072;2海南大学海洋学院，海口 570228

铁皮石斛(Dendrobium candidum Wall.ex Lindl)是兰科石斛属植物，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳的功效［1］，名列“中华九大仙草”之首，为《中华人民共和国药典》中收载的名贵中草药之一。现代药理研究表明铁皮石斛具有提高机体免疫力、防治白内障、抗疲劳、抗氧化、促消化、降血糖、降血压、抗肝损伤、抗肿瘤等功效［2，3］。植物化学成分分析表明铁皮石斛中主要的生物活性物质是多糖类化合物，且含量较高［4］，多糖含量的高低是目前判断铁皮石斛质量的主要依据［5］。

铁皮石斛为多年生植物，不同产地气候影响着植物代谢的过程，影响植物体内有效成分的形成与积累［6］，导致不同产区铁皮石斛的产量及质量有所差异，因此，有必要对不同产区铁皮石斛药材质量进行评价，为铁皮石斛的采收提供科学参考。目前，对于海南不同产区铁皮石斛有效成分比较还未见报道，本研究比较了铁皮石斛水提物，醇提物中主要成分及其与DPPH 自由基清除，还原力及α-淀粉酶抑制活性的关系，为海南产区铁皮石斛资源利用，铁皮石斛天然产物在药品及保健食品领域中的开发利用提供科学依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

UV-2450 紫外分光光度计(日本Shimadzu)，BP211D 分析天平(德国Sartorius)，恒温水浴锅(上海亚荣生化仪器厂)。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(美国Sigma，257621)，α-淀粉酶(上海晶纯生化科技股份有限公司，A109182)，其余试剂均购买于天津市化工技术有限公司。铁皮石斛药材从海南省琼中县宝元堂、三亚、儋州、保亭、五指山、昌江、乐东、陵水收集采购，由天津大学陈海霞教授鉴定。

1.2 不同产区铁皮石斛活性成分提取及分离纯化

将取自海南省上述八个产区的铁皮石斛粉碎后，分别精密称取铁皮石斛粗粉10 g，按1∶30(m/v)加入80%乙醇于80 ℃加热回流提取3 次，每次2 h，提取液合并后减压回收溶剂，真空冷冻干燥得到醇提物。取上述醇提物，经AB-8 大孔树脂吸附完全后，分别用30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇洗脱，每种洗脱液收集4 BV，浓缩后，测定总多酚及总黄酮含量，取富集部位分别计算铁皮石斛醇提物得率及主要成分含量。乙醇提取后的残渣，按1∶30(m/v)加入去离子水于100 ℃加热回流提取3 次，每次2 h，将提取液合并旋转蒸干后，真空冷冻干燥得到水提物，测定水提物得率及主要成分含量。

1.3 铁皮石斛醇提物中主要成分含量测定

1.3.1 总多酚含量测定

采用福林酚法测定总多酚含量［7］，取样品500 μL，加入500 μL 福林酚试液，20% Na2CO3溶液500 μL，加水补至5 mL，在760 nm 处测定吸光值。以没食子酸为标准品，绘制标准曲线，从标准曲线中计算总多酚含量。所有的测定都进行了三次重复。

1.3.2 总黄酮含量测定

采用氧化铝法测定总黄酮含量［7］，取样品250 μL，加入5% NaNO2溶液150 μL，摇匀放置6 min后，加入10% Al(NO3)3溶液150 μL，混匀放置6 min 后，加入1 mol/L NaOH 溶液2 mL，加水0.2 mL，摇匀后放置10 min，在510 nm 处测定吸光值。以芦丁为标准品，绘制标准曲线，从标准曲线中计算总黄酮含量。所有的测定都进行了三次重复。

1.4 铁皮石斛水提物中主要成分含量测定

1.4.1 中性糖含量测定

采用硫酸苯酚法测定中性糖含量［8］，取样品200 μL，加入5%苯酚，混匀后加入浓硫酸1.0 mL，静置冷却后，在490 nm 处测定吸光值。以葡萄糖为标准品，绘制标准曲线，从标准曲线中计算中性糖含量。所有的测定都进行了三次重复。

1.4.2 酸性糖含量测定

采用硫酸咔唑法测定酸性糖含量［8］，取样品250 μL，加入四硼酸钠溶液1.5 mL，混匀后在100℃下加热10 min，迅速冷却后加入50 μL 咔唑溶液，混匀后在100 ℃下加热15 min，迅速冷却至室温，在525 nm 处测定吸光值。以D-半乳糖醛酸为标准品，绘制标准曲线，从标准曲线中计算酸性糖含量。所有的测定都进行了三次重复。

1.4.3 蛋白质含量测定

采用考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量［8］，取样品500 μL，加入5.0 mL 考马斯亮蓝染液，混匀后，在595 nm 处测定吸光值。以牛血清蛋白为标准品，绘制标准曲线，从标准曲线中计算蛋白质含量。所有的测定都进行了三次重复。

1.4.4 总多酚含量测定

测试方法同1.3.1。

1.5 铁皮石斛醇提物及水提物抗氧化活性比较

1.5.1 铁皮石斛醇提物及水提物DPPH 自由基清除活性的测定

参照文献［8］，分别取不同浓度的样品(5、10、20、25、30 mg/mL)0.1 mL 与2.9 mL DPPH(120 μmol/L)充分混匀，37 ℃避光保温30 min，测量其在517 nm 下的吸光值，只加入样品溶剂的反应体系作为空白对照。样品DPPH 自由基清除率的计算公式为:I%=［(Ablank-Asample)/Ablank］×100。Ablank为空白对照的吸光度，Asample为样品的吸光度。

1.5.2 铁皮石斛醇提物及水提物三价铁还原/抗氧化性的测定

参照文献［8］，分别取不同浓度的样品(5、10、20、25、30 mg/mL)0.1 mL，加入0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH=6.6)0.7 mL，1%铁氰化钾溶液2 mL，50℃水浴20 min 后加10%三氯乙酸2 mL，混匀后离心(3000 × g)5 min。取上清液1 mL 加入1%三氯化铁3 mL，混匀后在700 nm 处测定吸光值，吸光值大表明还原力强。

1.6 铁皮石斛醇提物及水提物对α-淀粉酶抑制活性的比较

参照文献［9］，分别取上述醇提物及水提物(5 mg/mL)0.1 mL，加入α-淀粉酶，底物为淀粉溶液，加入DNS 溶液(1% 3，5-二硝基水杨酸和0.4 mol/L NaOH 溶解的12 %酒石酸钾钠)用于终止反应。反应液稀释20 倍后，测定其在540 nm 下吸光值，只加入样品溶剂的反应体系作为空白对照。样品α-淀粉酶抑制率的计算公式为:I%=［(Ablank-Asample)/Ablank］×100。Ablank为空白对照的吸光度，Asample为样品的吸光度。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛醇提物中总多酚，总黄酮的含量

表1 海南不同产区铁皮石斛醇提物得率，总多酚，总黄酮的含量Table 1 Comparative analysis of extraction yield，total phenolic contents and total flavonoids contents in alcohol extracts of D.candidum from different areas of Hainan

海南省八个不同产区铁皮石斛醇提物经AB-8大孔树脂进一步富集后，其总多酚，总黄酮含量见表1，其中琼中产区的铁皮石斛醇提物具有最高得率(61.23 mg/g)，其次为昌江(60.90 mg/g)、三亚(58.31 mg/g)、保亭(51.28 mg/g)，乐东、陵水产区所得铁皮石斛醇提物得率相对较低。总多酚含量由大到小对应的产区依次为:三亚＞琼中＞保亭＞五指山＞昌江＞乐东＞儋州＞陵水。总黄酮含量由大到小对应的产区依次为:琼中＞三亚＞保亭＞儋州＞昌江＞五指山＞乐东＞陵水。在这八个产区中，琼中、三亚、保亭三个产区铁皮石斛醇提物得率，总多酚，总黄酮均显示较高值。

2.2 铁皮石斛水提物中性糖，酸性糖，蛋白质，总多酚的含量

表2 海南不同产区铁皮石斛水提物得率，中性糖，酸性糖，蛋白质，总多酚的含量Table 2 Comparative analysis of extraction yield，neutral sugar contents，uronic acid contents，protein contents and total phenolic contents in aqueous extracts of D.candidum from different areas of Hainan

海南省八个不同产区铁皮石斛水提物的得率，中性糖，酸性糖，蛋白质，总多酚含量见表2，其中儋州产区的铁皮石斛水提物具有最高得率(214.96 mg/g)，其次为昌江(180.00 mg/g)，五指山(179.44 mg/g)，琼中、三亚、保亭产区所得铁皮石斛水提物得率相对较低。中性糖为铁皮石斛水提物的主要成分，其含量由大到小对应的产区依次为:五指山＞昌江＞乐东＞陵水＞儋州＞保亭＞琼中＞三亚。酸性糖含量由大到小对应的产区依次为:三亚＞保亭＞琼中＞儋州＞五指山＞乐东＞陵水＞昌江，酸性糖的含量大小顺序与中性糖的含量大小顺序基本呈现出相反的趋势。铁皮石斛水提物中所含蛋白质和多酚的含量相对较少，昌江产区蛋白质含量最高(13.46 mg/g)，三亚产区多酚含量最高(31.13 mg/g)。

2.3 铁皮石斛醇提物及水提物DPPH 自由基清除活性的测定

表3 海南不同产区铁皮石斛醇提物及醇提物DPPH 自由基清除活性Table 3 Scavenging activity against DPPH radical of alcohol extracts and aqueous extracts of D.candidum from different areas of Hainan

DPPH 自由基清除活性试验是常用的用来评价化合物抗氧化活性的指标之一，当DPPH 自由基与抗氧化剂发生反应后，颜色由深紫色变成亮黄色，通过测定波长517 nm 下的吸光值，比较被测物质DPPH 自由基清除活性［10］。表3 结果显示，比较同一产区铁皮石斛醇提物及水提物的DPPH 自由基清除活性，醇提物表现出较好的DPPH 自由基清除活性，水提物DPPH 自由基清除活性相对较低。琼中、三亚、保亭产区铁皮石斛醇提物显示较强DPPH 自由基清除活性，此三个产区醇提物中总多酚，总黄酮含量相对较高(表1)，儋州、五指山、昌江、乐东、陵水产区铁皮石斛水提物未显示DPPH 自由基清除活性，结合水提物主成分分析(表2)，相比其他产区，以上五个产区铁皮石斛水提物中所含酸性糖，总多酚含量较低，推测可能与该产区铁皮石斛DPPH 自由基清除活性较低有关。

2.4 铁皮石斛醇提物及水提物三价铁还原/抗氧化性的测定

图1 海南不同产区铁皮石斛醇提物及水提物还原力(n=3，means ± SD)Fig.1 Reducing power of alcohol extracts (A)and aqueous extracts (B)of D.candidum from different areas of Hainan (n=3，means ± SD)

还原力试验是另一种用来评价化合物抗氧化活性的指标之一，抗氧化物质将铁氰化钾中三价铁离子还原成二价铁离子，生成蓝色螯合物普鲁士蓝，通过在700 nm 波长下测定其吸光值来评价抗氧化性强弱［11］。图1 结果显示，同一产区铁皮石斛，醇提物(A)比水提物(B)表现出更高的还原力。同DPPH 自由基清除活性试验结果相似，不同产区铁皮石斛还原力活性有较大差异，琼中、三亚、保亭产区醇提物表现出较高的还原力，其对应的水提物及儋州产区水提物显示出较高的还原力，且表现出一定的浓度依赖性。

2.5 铁皮石斛提取物对α-淀粉酶抑制活性的测定

α-淀粉酶抑制剂能抑制肠道内唾液及胰α-淀粉酶的活性，阻碍食物中淀粉及其他碳水化合物的消化吸收，从而起到降血糖的作用［12］。图2 显示同等浓度下(5 mg/mL)，儋州产区铁皮石斛水提物表现出最高的α-淀粉酶抑制活性。与DPPH 自由基清除活性，还原力试验结果不同，相同产区铁皮石斛，其水提物比醇提物表现出更高的α-淀粉酶抑制活性，可能与水提物中含有较高含量的多糖有关，Gourgue［13］等人曾报道过多糖结构中大量游离羧基可以抑制酶的活性。

图2 海南不同产区铁皮石斛醇提物及水提物α-淀粉酶抑制活性(n=3，means ± SD)Fig.2 Inhibitory effects on α-amylase of alcohol extracts and aqueous extracts of D.candidum from different areas of Hainan (n=3，means ± SD)

2.6 铁皮石斛中的活性成分与抗氧化性，降血糖活性的线性关系

表4 铁皮石斛醇提物及水提物中主要成分含量与DPPH 自由基清除活性，还原力，α-淀粉酶抑制活性的Pearson 相关系数Table 4 Correlation coefficients (Pearson’s correlation coefficient)of the contents of main components in alcohol extracts and aqueous extracts of D.candidum with the DPPH radical scavenging activity，reducing power and α-amylase inhibition activity

为了研究铁皮石斛中有效成分对抗氧化，降血糖活性的影响，通过SPSS 软件计算Pearson 相关系数(P＜0.05)，Pearson 相关系数越接近1，说明该成分与对应的活性相关性越高。从表4 可以看出，醇提物总黄酮含量与DPPH 自由基清除活性，还原力有显著的线性相关性(r=0.867，P＜0.01;r=0.836，P＜0.01)，总多酚表现出相对较高的相关性(r=0.904，P＜0.01;r=0.861，P＜0.01)，可推测得出总多酚可能是铁皮石斛醇提物中主要的抗氧化活性成分之一。水提物中性糖，蛋白质含量与DPPH自由基清除活性，还原力无相关性，说明铁皮石斛水提物中以上两种成分抗氧化活性较小。水提物酸性糖，总多酚含量与DPPH 自由基清除活性，还原力有很好的线性相关性(r=0.752，0.762;r=0.725，r=0.807)。此外，水提物，醇提物中检测的成分与α-淀粉酶抑制活性无明显相关性，对于铁皮石斛的α-淀粉酶抑制活性及有效成分还有待进一步研究。

3 结论

本研究对海南八个不同产区铁皮石斛水提物及醇提物主要成分，DPPH 自由基清除活性，还原力和α-淀粉酶抑制活性进行评价。其中琼中、三亚、保亭产区铁皮石斛水提物及八个产区铁皮石斛醇提物均表现出较高的DPPH 自由基清除活性及还原力活性，儋州产区铁皮石斛水提物表现出较高的α-淀粉酶抑制活性。铁皮石斛中性糖，蛋白质含量与抗氧化活性的线性相关系数较小，酸性糖，总多酚，总黄酮与抗氧化活性有较好的线性相关性，其中醇提物中总多酚表现出相对最高的线性相关(r=0.904，P＜0.01;r=0.861，P＜0.01)。由此推断总多酚是铁皮石斛中抗氧化的活性成分之一。参考上述研究结果，可根据铁皮石斛在药品及保健食品中的用途，选择性的采收某些产区的铁皮石斛以及针对性的提取活性成分，提高铁皮石斛在开发过程中的资源利用率。

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