稀碱-Fenton试剂预处理对云南苦竹酶水解得率的影响

王燕云， 杨 静

(1.西南林业大学 云南省木材胶黏剂及胶合制品重点实验室,云南 昆明 650224;2.西南林业大学 材料工程学院，云南 昆明 650224)

·研究报告——生物质化学品·

稀碱-Fenton试剂预处理对云南苦竹酶水解得率的影响

王燕云1,2， 杨 静

(1.西南林业大学 云南省木材胶黏剂及胶合制品重点实验室,云南 昆明 650224;2.西南林业大学 材料工程学院，云南 昆明 650224)

利用响应面法对稀碱-Fenton反应预处理竹粉的条件进行优化，确定最佳的Fenton预处理条件为：1 g 稀碱预处理后竹粉底物加入质量分数30 %的 H2O2溶液3.4 mL，Fe2+浓度15.8 mmol/L，反应时间12 h，获得的 72 h 酶水解得率为49.98%。与原料和经2%NaOH 预处理后的样品相比，经2%NaOH-Fenton 预处理后的样品中纤维素含量升高，半纤维素和木质素含量降低，72 h酶水解得率为48.24%，分别提高了47.79和37.44个百分点。当纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的用量分别为32 FPIU/g和16 IU/g(以纤维素质量计)时，72 h 酶水解得率为76.64%，比单独使用纤维素酶时的酶水解得率提高了22.80%。

响应面法；Fenton反应；酶水解得率

纤维素乙醇作为一种可再生的能源，其经济前景和环境效益越来越受重视[1]。纤维素乙醇的制备主要经过原料预处理、纤维素酶水解、糖液(戊糖、己糖)乙醇发酵和酒精蒸馏脱水等过程[2]。尽管木质纤维生物质是地球上最多的碳水化合物，来源广泛、价格低廉，但其利用也面临很多挑战，如木质纤维生物质的结构复杂、糖苷键对纤维素酶的不可及度低、处理过程中可溶性抑制物的形成、混合糖的发酵效率低等均使得原料预处理成为限制木质纤维素利用的瓶颈。木质纤维原料预处理的主要目的是破坏木质纤维的超分子结构，使原料中纤维素、半纤维素和木质素实现分离，提高纤维素酶对纤维素的可及度，从而提高纤维素的酶水解性能[3]。研究证实预处理过程的费用占总成本的20%左右[4-5]，因此开发一种高效率、低能耗、低成本的预处理方法是当前的研究热点。H2O2与Fe2+催化剂构成的氧化体系称为Fenton试剂，其发生的氧化反应称为Fenton反应(H2O2+Fe2+→H2O+Fe3++·OH)。其本质是在Fe2+离子的催化作用下H2O2的分解活化能低(34 kJ/mol)，能够产生大量的中间产物羟基自由基(·OH)，并依靠羟基自由基氧化分解有机物。本研究拟建立一种稀碱-Fenton试剂预处理竹粉的两段预处理方法，NaOH能使纤维素润胀，利于木质素的溶出；而Fenton反应产生的·OH使底物中纤维素结构疏松和纤维素三维结构发生变化，最终达到提高后续酶水解效率的目的。

1 实 验

1.1 材料

云南苦竹(Pleioblastusamarus(Keng)Keng f.)的竹片残渣来自云南省云景林纸股份有限公司，经粉碎，过筛孔直径0.30～0.45 mm得到竹粉，其化学组成为：纤维素41.23%、木聚糖22.30%、酸溶木质素1.36%、酸不溶木质素29.83%、 灰分3.03%。

H2O2(质量分数≥30%)，七水合硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)，为淡蓝绿色结晶。所用试剂均为分析纯。

里氏木霉纤维素酶和β-葡萄糖苷酶均由丹麦诺维信(Novozyme)公司生产，Sigma 公司提供。里氏木霉纤维素酶的滤纸酶活125 FPIU/mL,β-葡萄糖苷酶酶活330 IU/mL。

1.2 稀碱预处理

将竹粉在20 g/L的NaOH 溶液、固液比1∶10(g∶mL，下同)和65 ℃下处理2 h。反应结束，用蒸馏水洗涤固体残渣，作为Fenton反应的底物。

1.3 Fenton反应预处理

取稀碱预处理后的竹粉1 g，加入质量分数30% H2O22～4 mL，调节Fe2+浓度5.79～15.79 mmol/L，固液比1∶10，并于pH值3.0和16.76 r/s 的条件下反应12～36 h。反应结束后，用蒸馏水洗涤固体渣，作为纤维素酶水解反应的底物。

1.4 酶水解方法

取绝干质量为10 g的预处理料置于250 mL三角瓶中，加入一定量的水、柠檬酸缓冲液和纤维素酶液，使底物质量分数为10%，溶液pH值为4.8，酶用量为15 FPIU/g(以纤维素质量计，下同)。充分搅拌均匀后，置于50 ℃、150 r/min的摇床中反应。分别于2、4、8、12、24、48、72 h取样，于3 000 r/min下离心10 min，取上清液适当稀释后用高效液相色谱(HPLC)测定反应液中葡萄糖和纤维二糖的浓度变化，并计算纤维素酶水解得率[6-7]。纤维素水解得率(Y)可用下式计算：

Y=(c×V×0.9)/(m×w)×100%

式中：Y—纤维素水解得率，%； c—水解液中葡萄糖和纤维二糖质量浓度，g/L；V—水解液体积，L； 0.9—纤维素和葡萄糖之间的转换系数；m—原料质量，g；w—原料中纤维素的质量分数，%。

1.5 响应面分析方法

根据Box-Benhnken 的中心组合试验设计原理[8]，综合前期试验结果，选取Fe2+浓度、30%H2O2用量、反应时间，采用3因素3水平的响应面分析方法进行试验条件优化，采用Design-Expert, Version 7.0软件进行试验设计与数据分析。

1.6 分析方法

1.6.1 水分含量的测定 水分含量的测定采用红外线水分计FD-720测定。

1.6.2 纤维素、半纤维素和木质素的测定 样品的纤维素、半纤维素和木质素的组成按美国可再生能源实验室公布的方法测定[9]。

1.6.3 酶水解液中糖组分的测定 采用高效液相色谱(HPLC, Agilent technology 1100 series, Palo Alto, CA)法测定酶水解液中的糖组分。酶水解后的上清液经0.45 μm 滤膜过滤后，用Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm)色谱柱，以0.005 mol/L 的硫酸作为流动相，流速为0.6 mL/min，在示差折光检测器(RI)上进行检测。

2 结果与分析

2.1 响应面优化试验及结果分析

综合前期试验的结果，运用Design-Expert 7.0 软件，根据Box-Behnken 中心组合试验设计原理，以酶水解得率为响应值，选择30% H2O2用量(X1)、Fe2+浓度(X2)和反应时间(X3)为变量，进行3因素3水平响应面试验，试验设计及结果如表1 所示。

表1 响应面试验设计及结果

响应面设计共有17 个试验点，其中12 个为分析因子，5 个为零点，零点试验用作误差估计。对表1试验得到的响应值进行多元回归拟合，得到以酶水解得率为目标函数的二次多元回归方程：Y=48.22+1.58X1+1.62X2+0.66X3+0.20X1X2+0.23X1X3-1.23X2X3-1.17X12-0.92X22+0.52X32回归方程中，各项系数的绝对值大小反映了各因素对酶水解得率的影响程度。由该方程可知，对酶水解得率的影响顺序由大到小为：Fe2+浓度、H2O2用量、反应时间。对上述回归模型进行方差分析以检验方程的有效性，方差分析结果见表2。

表2 回归模型方差分析

回归方程中各变量对响应值影响的显著程度由F检验判定，模型P值小于0.000 1，远远小于0.050 0，表明该模型具有较高的显著水平；且相关系数R2=97.96%，说明响应值的变化有97.96%来源于所选3个变量，即30% H2O2用量，Fe2+浓度和反应时间。失拟差项P值为0.055 7且大于0.050 0,表明失拟差项不显著，试验模型的失拟度好。可以用该模型对实验结果进行预测和分析。

对因素X1、X2、X3及其交互项X1X2、X1X3、X2X3进行分析，一次项X1、X2和X3的P值均小于0.050 0，表明质量分数30%的H2O2，Fe2+浓度和反应时间这3个变量对酶水解得率的影响都具有较高的显著性；二次项X12，X22，X32的P值也都小于0.050 0，说明质量分数30%的H2O2，Fe2+浓度和反应时间都具有较高的显著性，对响应值的影响相对复杂，具有显著的曲面效应；交互项X2X3的P值小于0.050 0，说明Fe2+浓度和反应时间的交互影响显著。

利用模型确定最佳的酶水解条件为30% H2O23.36 mL，Fe2+浓度15.79 mmol/L，反应时间12 h，预测在该条件处理下的酶水解得率为50.53%。图1是各个变量相互之间的响应面曲线图，每个图表示的是当一个变量为编码零水平时其他两个变量的相互作用对响应值的影响[10]。

图1 响应曲面图

由图1可以看出质量分数30%的H2O2用量、Fe2+浓度和反应时间这3个变量对酶水解得率的影响程度。在图1(a) 中，Fe2+浓度对酶水解得率的影响程度大于质量分数30%的H2O2；图1(b)显示Fe2+浓度对酶水解得率的影响程度大于反应时间；图1(c) 可以看出，质量分数30%的H2O2对酶水解得率的影响程度大于反应时间。由此可知，各因素对酶水解得率的影响程度为：Fe2+浓度>H2O2用量>反应时间。

2.2 验证实验

为检验响应面结果的有效性，在1 g预处理后竹粉中加入质量分数30%的H2O2溶液3.4 mL，Fe2+浓度15.8 mmol/L，反应时间12 h的条件下进行了3组平行的验证试验，酶水解得率分别为49.35%、49.87%和50.73%,平均值为49.98%。实验说明该回归方程与实际实验有较好的拟合度，证明响应面优化法得到的最佳参数是合理的。

2.3 NaOH-Fenton预处理对化学组分及酶水解得率的影响

为了解两段预处理方法对样品化学组成的影响，分别测定了3种样品的化学组成；并且在底物质量分数10%，pH值4.8,50℃，搅拌速度150 r/min，纤维素酶用量15 FPIU/g的条件下水解72 h，结果如表3所示。

表3 3种样品的化学组成和酶水解得率

木质纤维原料中纤维素、半纤维素和木质素之间形成的致密结构不利于纤维素酶与纤维素的接触，因此木质纤维原料在纤维素酶水解前必须经过预处理。稀碱预处理有利于断裂木质素、纤维素和半纤维素之间的酯键连接，溶出木质素，同时对纤维素进行润胀，降低纤维素的结晶度，从而提高原料中纤维素酶对纤维素的可及度，促进后续的酶水解作用。Fenton反应产生的·OH具有较强的氧化性，可夺取葡萄糖单体上的羟基的电子，使其氧化为醛基，从而使底物中纤维素和半纤维素结构疏松，最终达到提高后续酶水解效率的目的。由表3可知，与原料相比，经2% NaOH 预处理后的样品中木质素含量降低，纤维素含量升高，72 h酶水解得率10.80%比原料的0.45%提高了10.35个百分点。经2% NaOH-Fenton 预处理后的样品中半纤维素含量比原料和经2% NaOH 预处理后的样品中减少了50%左右，纤维素含量增加。72 h酶水解得率为48.24%，分别比原料和经2% NaOH 预处理后的酶水解得率提高了47.79和37.44个百分点。由此可知，把稀碱-Fenton反应用于原料的预处理可以明显破坏木质纤维原料的结构，降低木质素和半纤维素的含量，提高纤维素与纤维素酶之间的接触，从而提高酶水解得率。

2.4 酶用量对酶水解得率的影响

在底物质量分数10%，pH值4.8,50 ℃，搅拌速度150 r/min，纤维素酶和β-葡萄糖苷酶用量比为2∶1，最大纤维素酶和β-葡萄糖苷酶用量分别为32 FPIU/g和16 IU/g，并且在响应面优化得出的最佳Fenton条件下，稀碱-Fenton试剂预处理后的竹粉水解72 h，结果如表4 所示。

表4 酶用量对酶水解得率的影响

由表4 可知，酶水解得率随着纤维素酶用量的增加而增加，但当酶用量达到一定值后，酶水解得率增加幅度变小，当纤维素酶用量为20 FPIU/g时，72 h的水解得率为55.86%。纤维素酶为一复合酶系，主要由内切型(β-1，4)葡聚糖酶、外切型(β-1，4)葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶组成[11]。在纤维素酶水解纤维素的过程中，内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶受不断增加的纤维二糖抑制，而β-葡萄糖苷酶对葡萄糖的累积更敏感，但对于整个纤维素酶系来说，纤维二糖的抑制作用强于葡萄糖。里氏木霉是目前公认的最有工业应用前景的可用于木质纤维原料糖化的纤维素酶生产菌株，而里氏木霉自身β-葡萄糖苷酶分泌量的不足可通过外源添加β-葡萄糖苷酶的辅助方式实现对纤维素的高效水解。在一定的范围内，糖化率随着体系中β-葡萄糖苷酶活力的增加而增加，当β-葡萄糖苷酶活力增加到一定程度后，糖化程度就基本趋于恒定。采用纤维素酶和β-葡萄糖苷酶用量比2∶1，从表4 可看出，添加外源β-葡萄糖苷酶后，纤维素酶水解得率均有大幅度的提高，当纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的用量分别为32 FPIU/g和16 IU/g时，酶水解得率为76.64%，比单独使用纤维素酶时的酶水解得率62.41%提高了22.80%。添加外源的β-葡萄糖苷酶后，商品酶和自产酶的酶系结构趋于合理，β-葡萄糖苷酶与内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的协同作用较好，纤维素酶的整体水解效率提高。

3 结 论

3.1 利用响应面法优化稀碱-Fenton试剂预处理竹粉的条件，得到最佳的Fenton预处理条件为： 1 g稀碱预处理后竹粉底物加入质量分数30%的H2O2溶液3.4 mL， Fe2+浓度15.8 mmol/L，反应时间12 h，获得的酶水解得率为49.98%。

3.2 与原料和经2% NaOH 预处理后的样品相比，经2% NaOH-Fenton 预处理后的样品中纤维素含量升高，半纤维素和木质素含量降低，72 h酶水解得率为48.24%，分别提高了47.79和37.44个百分点。

3.3 当纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的用量分别为32 FPIU/g和16 IU/g(以纤维素质量计)时，72 h酶水解得率为76.64%，比单独使用纤维素酶时的酶水解得率提高了22.80%。

[1]蒋剑春.生物质能源转化技术与应用(Ⅰ)[J].生物质化学工程,2007,41(3):59-65.

[2]MAIS U,ESTEGHLALIAN A R,SADDLER J N,et al. Enhancing the enzymatic hydrolysis of cellulosic materials using simultaneous ball milling[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2002,98:815-832.

[3]马斌,储秋露,朱均均,等.4 种木质纤维素预处理方法的比较[J].林产化学与工业,2013,33(2):25-30.

[4]BANERJEE S,SEN R,GIRI B,et al.Commercializing lignocellulosic bioethanol:Technology bottlenecks and possible remedies[J].Biofuels Bioproducts and Biorefining,2010,4(1):77-93.

[5]YANG B,WYMAN C E. Pretreatment:The key to unlocking low-costcellulosic ethanol[J].Biofuels Bioproducts and Biorefining,2008,2(1):26-40.

[6]BALLESTEROS I,OLIVA J M,NEGRO M J,et al.Enzymatic hydrolysis of steam exploded herbaceous agricultural waste (Brassicacarinata) at different particule sizes[J].Process Biochemistry,2002,38(2):187-192.

[7]CHEN Ming,ZHAO Jing,XIA Li-ming.Enzymatic hydrolysis of maize straw polysaccharides for the production of reducing sugars[J]. Carbohydrate Polymers,2008,71(3):411-415.

[8]吴有炜.试验设计与数据处理[M].苏州:苏州大学出版社,2002:115-154.

[9]SLUITER A,HAMES B,SCARLATA C,et al.DE-AC3608GO28308-2008,Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass[S].United States:National Renewable Energy Laboratory Golden,CO,2008.

[10]朱均均,朱圆圆,程婷,等.玉米秸秆乙酰基水解产物对乙醇发酵的影响及去除策略[J].林产化学与工业,2014,34(1):1-7.

[11]NOGAWA M,GOTO M,OKADA H,et al.L-Sorbose induces cellulose gene transcription in the cellulolytic fungusTichodermareesei[J].Current Genetics,2001,38(6):329-334.

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Influence of Alkaline-Fenton Pretreatment on the EnzymaticHydrolysis Yield of Yunnan Bamboo

WANG Yan-yun1,2, YANG Jing1,2

(1.Yunnan Provincial Key Laboratory of Wood Adhesives and Glued Products,Southwest Forestry University， Kunming 650224,China； 2.College of Materials Science and Engineering,Southwest Forestry University, Kunming 650224, China)

The optimum reaction conditions of alkaline-Fenton pretreatment of bamboo were obtained through the response surface methodology. The results showed that the optimum conditions of Fenton reaction were alkaline treated bamboo 1 g, 30% H2O23.4 mL, concentration of Fe2+15.8 mmol/L, and reaction time 12 h. The 72 h enzymatic hydrolysis yield was 49.98%. The sample pretreated by 2% NaOH-Fenton had higher cellulose content and lower hemicellulose and lignin content compared with the materials and sample pretreated by 2% NaOH. The 72 h enzymatic hydrolysis yield was 48.24% and increased by 47.79% and 37.44%, respectively. The 72 h enzymatic hydrolysis yield was 76.64% when the dosage of the cellulase and theβ-glucosidase were 32 FPIU/g and 16 IU/g, respectively. This was 22.80% higher than that with the single use of the cellulase 32 FPIU/g.

response surface methodology; Fenton reaction; enzymatic hydrolysis yield

10.3969/j.issn.1673-5854.2015.05.004

2015- 05- 25

国家自然科学基金资助项目(31260162)

王燕云(1991—),女，江苏苏州人，硕士生，研究方向为生物质能源

*通讯作者：杨 静(1976—)，女，博士，副教授，硕士生导师，主要从事木质纤维素的生物降解与转化的研究；E-mail:kmjingyang@163.com 。

TQ35

A

1673-5854(2015)05- 0017- 06