黄芩中抗菌有效成分提取工艺研究

王 雪， 刘燕隔， 逯家辉， 王春月， 贾冰璇， 孟庆繁， 张 洋， 王 迪

(吉林大学 生命科学学院， 吉林 长春 130012)

·研究报告——生物质活性成分·

黄芩中抗菌有效成分提取工艺研究

王 雪， 刘燕隔， 逯家辉， 王春月， 贾冰璇， 孟庆繁， 张 洋， 王 迪*

(吉林大学 生命科学学院， 吉林 长春 130012)

在单因素试验的基础上，选取提取温度、提取时间和液料比为影响因素,应用 Box-Behnken中心组合进行3因素3水平的试验设计,以对白色念珠菌产生的抑菌圈直径作为响应值,对结果进行多元线性和二项式拟合,采用响应面(RSA)法选取黄芩中抗菌有效成分提取的最佳工艺条件。最佳工艺条件为:提取温度61 ℃，提取时间2 h，液料比13∶1(mL∶g),经3次验证实验得黄芩水提物质量浓度为0.5 g/mL时，抑菌圈平均直径为12.637 mm，与预测值12.665 mm接近，阳性对照枯草杆菌肽的平均抑菌圈直径为11.85 mm，表明响应面法优化得到的黄岑水提物对白色念珠菌的抑菌作用显著。

黄芩；抗菌成分；提取工艺；中心组合设计-响应面法

黄芩为唇形科植物黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根，具有清热燥湿，泻火解毒之功效。黄芩的粗提物及其活性部位、单体具有抗真菌、抗突变、抗炎症、抗血管平滑肌增殖、抗氧化和抗肿瘤等多方面的药理活性和很好的临床价值[1-5]。白念珠菌(Canidiaalbicans)是临床最常见的女性妇科疾病致病真菌[6]，目前治疗妇科炎症类疾病的抗生素和化学合成类药物极为有限, 且毒副作用较大,中草药在抗白念珠菌感染的预防和治疗中的应用克服了上述问题[7],大量研究表明,黄芩对白念珠菌等深部真菌感染有良好的抗菌作用[8]。 中心组合设计-响应面分析法(RSM)能将多因素试验中各个因素与响应值之间的复杂关系，以多元二次回归方程表示，简单、快速地对实验进行全面的研究，并得到最优化参数[9]，被广泛的应用于中药提取工艺优化[10]、菌粉发酵工艺优化[11]及胞内有效成分提取优化[12]中。本研究采用响应面法对黄芩抗菌有效成分提取工艺进行研究，通过实验数据拟合模型，研究了提取温度、提取时间和液料比对黄芩中抗菌有效成分的影响以及各因素之间的相互作用，确定了最优的提取工艺，为黄芩抗菌、抗病毒新药的开发提供了理论依据。

1 实 验

1.1 材料与仪器

黄芩药材购自吉林省龙康药业有限公司。白色念珠菌购自中国药品生物制品检定所(ATCC 10231)。阳性对照药枯草杆菌肽购于上海，阿拉丁试剂；酵母浸粉、蛋白胨,均为BR,北京奥博星生物技术有限责任公司；氯化钠,AR；琼脂粉,生化试剂。

HDM-2000回流装置,北京中兴伟业仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发器；BS2243电子分析天平；ZHJH-C1109C超净工作台,上海智城分析仪器制造有限公司；HZQ-F160A高低温恒温振荡培养箱,上海一恒科技有限公司；Mf 3菌落自动计数多功能一体机,杭州迅数公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的制备 LB液体培养基:酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L，以NaOH调节pH值至7.2～7.4,121 ℃高压灭菌30 min,备用。 LB固体培养基:酵母浸粉5 g/L,蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L，以NaOH调节pH值至7.2～7.4，琼脂粉20 g/L,121 ℃高压灭菌30 min,备用。

1.2.2 菌种的活化 菌株于实验前接种于沙氏斜面,37 ℃培养24 h，活化2次, 使之处于对数生长期,用血细胞计数板计数,以沙氏液体培养基调整菌液浓度至106CFU/mL。

1.2.3 抑菌效果的测定 采用滤纸片平板扩散法测抑菌效果。用无菌移液管取0.5 mL菌浓度为106CFU/mL的菌悬液于湿热灭菌的培养皿中,再将经高压蒸气灭菌后的培养基冷却至50～60 ℃,无菌操作倾注于加有0.5 mL菌液的培养皿中,每皿约15～20 mL的培养基,将培养皿置于超净工作台上轻轻摇动,将菌与培养基充分混匀,制成含菌平板。将灭菌后直径6 mm的滤纸片置于一定质量浓度的黄芩水提物中，浸泡30 min后取出,自然烘干,按无菌操作贴于含菌平板上，阴性对照组为不加黄岑水提物的处理液，阳性对照组为枯草杆菌肽，每皿贴4片,置于37 ℃培养箱中培养18～24 h后，用全自动菌落计数仪观察有无抑菌作用,并测量其抑菌圈的大小，取平均值。

1.2.4 单因素试验 精密称取干燥的黄芩饮片15 g，在一定温度下按一定的液料比加入适量水，于回流装置中提取,滤出药液后减压浓缩, 静置5 h，取上清液，即为黄芩水提物。主要考察提取温度、提取时间和液料比对黄芩中抗菌有效成分的影响。

1.2.5 中心组合设计-响应面法优化提取条件 在单因素试验的基础上，进行3因素3水平的Box-Benhnken中心组合试验设计[13-15]。采用响应面分析法研究3个随机因素(提取温度、提取时间和液料比)对响应值(抑菌圈直径)的影响。每一自变量的低、中、高水平分别以-1、0、1进行编码。用SAS V 8.0的实验设计工具箱对试验结果进行回归拟合，对回归方程和关键因素进行方差分析，并得到最优的抗菌有效成分提取条件。应用Matlab 7.0根据响应方程绘制响应曲面图和等高线图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取温度 液料比10∶1(mL∶g，下同)，提取温度分别为60、70、80、90和100 ℃，提取1 h，药液浓缩至适当浓度，静置5 h，取上清液，测定各组水提物对白色念珠菌的抑菌活性，结果如图1所示。从图1中可以看出，当温度高于70 ℃时，随着提取温度的逐渐增加，黄芩水提物对白色念珠菌产生的抑菌圈直径逐渐减小，可能由于黄芩中有效抑菌活性成分经高温加热后易失活，故黄芩中抗菌有效活性成分提取的最佳温度为70 ℃。

2.1.2 提取时间 液料比10∶1,提取温度70 ℃条件下分别提取1、2、3、4和5 h，药液浓缩至适当浓度，静置5 h，取上清液，测定各组水提物对白色念珠菌的抑菌活性，结果如图2所示。从图2可以清楚的看出，随着提取时间的增加，黄芩提取物的抑菌活性增加，2 h后抑菌圈直径下降，故选择黄芩抗菌有效成分的提取时间单因素优化值为2 h。

2.1.3 液料比 在筛选得到的最佳提取温度70 ℃，提取时间2 h下，分别按液料比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1和40∶1对黄芩进行提取，药液浓缩至适当浓度，静置5 h，取上清液，测定各组水提物对白色念珠菌的抑菌活性，结果如图3所示。从图3中可以看出，液料比高于10∶1后，抑菌圈直径有所降低，故选择黄芩抗菌有效成分提取的最优液料比为10∶1。

图1 提取温度对抑菌圈直径的影响

Fig.1 Effect of extraction temp. on the bacteriostatic circle diameter

图2 提取时间对抑菌圈直径的影响

Fig.2 Effect of extraction time on the bacteriostatic circle diameter

图3 液料比对抑菌圈直径的影响

Fig.3 Effect of solvent/solid on the bacteriostatic circle diameter

2.2 响应面法优化黄芩抗菌有效成分提取条件

2.2.1 提取条件优化 根据单因素试验得到的优化结果，以提取温度(X1)、提取时间(X2)和液料比(X3)为自变量，抑菌圈直径Y为响应值，进行3因素3水平的Box-Behnken中心组合实验设计，因素和水平的设计及实验结果如表1所示，采用多元二次回归方法对试验结果进行响应分析，并采用偏导方法求解多元二次回归方程的极值，得到最佳提取条件。

表1 Box-Behnken中心组合设计方案及试验结果

采用SAS RSREG程序对表1中数据进行响应面分析，多元二次回归方程为:

响应面二次回归模型ANOVA分析结果如表2所示。该模型的R2值为0.978 1，P值为0.001 3,说明试验点的数据的这种拟合方法是合理可靠的, 使用该方程模拟真实的3因素3水平的分析是可行的。各因素的显著作用采用P检测和F检测方法。t值越大，P值越小则该因素对响应值的影响越显著。从结果中可以看出，提取温度(X1)对抑菌圈直径的影响非常大，P值为0.003 5，对二次变量而言，X1X3、X22项P值分别为0.000 6、 0.000 2，对Y值有极显著影响(P<0.001)，X12、X32项P值分别为0.004 7和0.006 3，对Y值有显著影响(P<0.05)。

表2 回归分析结果

根据回归方程，绘制响应面图，结果如图4所示。从各因素之间两两相互作用的响应面图形观察，发现其中曲线走势越陡，其影响越显著；曲线走势越平滑，其影响越小。提取温度、液料比和提取时间的图形曲线走势较陡，说明其对抑菌圈直径影响最为显著。

图4 响应面图和等高线图

采用SAS工具箱计算黄芩抗菌有效活性成分最优提取条件的编码值为：X1=-0.863 74，X2=0.073 316,X3=0.657 436。根据编码值与非编码值的转换式解得真实值为X1=61.36，X2=2.037，X3=13.285。因此，将数据圆整后可得黄芩中抗菌有效成分的最佳提取工艺为：提取温度61 ℃、提取时间2h、液料比13∶1。由回归方程预测对白色念珠菌产生的抑菌圈理论值可达到12.665mm。

2.2.2 验证实验 为检验响应面法的可行性，采用模型预测的最佳提取条件进行黄芩中抗菌有效成分提取的验证实验，采用的提取工艺为提取温度61 ℃,提取时间2h,液料比13∶1。3次平行试验得到当黄芩水提物质量浓度为0.5g/mL时，抑菌圈的平均值为12.637mm，相对误差小于0.1%，可见预测值与试验值吻合得很好，具有实际应用价值。

2.3 抑菌性比较

按照响应面法优选的最佳工艺条件对黄芩进行提取，并减压浓缩到质量浓度0.5 g/mL，另作阳性和阴性对照进行抑菌活性的测定，黄芩水提物浓缩液对白色念珠菌平均抑菌圈直径为12.64 mm，阳性对照组平均抑菌圈直径为11.85 mm，阴性对照组平均抑菌圈直径为0 mm。

3 结 论

采用单因素及中心组合设计-响应面法优化黄芩中抗菌有效活性成分的提取工艺，实验结果表明, 最优的提取工艺为：提取温度61 ℃、提取时间2 h、液料比13∶1(mL∶g)，在此条件下0.5 g/mL的黄芩水提物，能够显著抑制白色念珠菌活性，抑菌圈的平均直径为12.637 mm，与理论预测值(12.665)的相对误差小0.1%。

[1]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海:上海科学技术出版社,1992:41-45.

[2]邓虎占,黄泽宏,余静.中药现代研究与应用:第四卷[M].北京:学苑出版社,1998:39-43.

[3]张虹,范春水.黄芩有效成分对心脑血管的作用[J].中国新医药,2004,3(3):63-64.

[4]张曦,李宏,侯茂军,等.黄芩及其有效成分的药理学研究进展[J].天津医学,2000,12(4):8-11.

[5]程存归,金文英,吴兰菊.从黄芩中微波辅助提取黄芩苷的研究[J].林产化学与工业,2005,25(1):81-83.

[6]焦士蓉,黄承钰.柑橘属类黄酮生物活性的研究进展[J].西华大学学报,2008,27(1):32-35.

[7]付婷婷,吴建元,王黎,等.从中药筛选治疗阴道炎的抗菌处方[J].中药材,2006,29(9):931-935.

[8]熊英,傅颖媛,况南珍,等.黄芩苷抗白念珠菌作用及机制研究[J].中国药理学通报,2004,20(12):1401-1407.

[9]张娜,周卫,王文溪,等.响应面法优化白囊耙齿菌中腺苷的提取工艺[J].中国生化药物杂志,2011,32(5):370-377.

[10]刘伟,孙维峰,吴新荣.响应面法在优化中药提取工艺中的应用[J].中华中医药学刊,2014,32(8);690-692.

[11]ZHANG Na,LI Quan,WANG Juan,et al.Screening ofIrpexlacteusmutant strains and optimizing fermentation conditions[J].Journal of Food,Agriculture&Environment,2014,12(2):1213-1219.

[12]宋时春,俞兆程,赵德义,等.桦褐孔菌多糖的提取工艺优化[J].中国现代应用药学,2014,31(2):167-172.

[13]杨玲,王振宇.响应面法优化蓝靛果抗氧化成分提取的工艺研究[J].林产化学与工业,2010,30(1):67-72.

[14]商小金,钱俊青,郭辉.响应面法优化延胡索生物碱乙醇提取工艺研究[J].林产化学与工业,2010,30(2):32-36.

[15]张宇思,王成章,舒阿庆,等.响应面法优化超声波辅助提取报批樟多酚工艺[J].生物质化学工程,2014,49(5):19-23.

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Extraction of Effective Ingredients fromScutellariaBacalensisGeorgi

WANG Xue， LIU Yan-ge， LU Jia-hui， WANG Chun-yue， JIA Bing-xuan， MENG Qing-fan，ZHANG Yang， WANG Di

(School of Life Science,Jilin University, Changchun 130012, China)

In order to optimize the extraction condition for effective active ingredient from Scutellaria Bacalensis Georgi, a three-factor-three-level experiments design was developed by using Box-Benhken central composite design method based on single-factor experiments with extraction temperature, extraction time, solvent-solid ratio as influence factors. The bacteriostatic ring diameter againstCandidaalbicanswas used as the responsive values. The data were fitted by using multi-linear equation and second-order polynomial equation. And the extraction conditions were optimized by response surface method. The optimum conditions were as follows: extraction temperature 61 ℃, extraction time 2 h and solvent-solid ratio 13∶1. Under these conditions,the average diameter of bacteriostatic circles verified by three experiments was 12.637 mm closing to the predicted value(12.664 88 mm)，when the concentration of extractions was 0.5 g/mL.And the average diameter of bacteriostatic circle of positive contrast was 11.85 mm.The results showed that the aqueous extract ofScutellariabacalensisGeorgi had significant bacteriostatic effects onCandidaalbicans.

ScutellariabacalensisGeorgi; antibacterial ingredient; extraction; central composite design-response surface metho- dology

10.3969/j.issn.1673-5854.2015.05.007

2014- 04- 03

吉林省教育厅“十二五”科学技术研究规划项目(3R114P821413)

王 雪(1990—)，女，黑龙江齐齐哈尔，硕士生，主要从事微生物与生化药学研究

*通讯作者：王 迪，讲师，研究方向为微生物与生化药学、分子药理学；E-mail:jluwangdi@outlook.com。

TQ35

A

1673-5854(2015)05- 0034- 05