精索静脉曲张对大鼠睾丸内分泌功能的影响

苗　蕊，贾晓鹏,李　斌,郭　婧,孙云朝,冯栋栋



精索静脉曲张对大鼠睾丸内分泌功能的影响

苗蕊，贾晓鹏,李斌,郭婧,孙云朝,冯栋栋

[作者单位]050082 石家庄，解放军白求恩国际和平医院妇产科(苗蕊、郭婧)；050051 石家庄，河北医科大学第三医院泌尿外科(贾晓鹏)；063000 河北 唐山，唐山工人医院泌尿外科(李斌)；050011 石家庄，河北省中医院外科(孙云朝)；255000 山东 淄博，淄博市中西医结合医院泌尿外科(冯栋栋)

[摘要]目的探讨精索静脉曲张(VC)对大鼠睾丸支持细胞分泌功能的影响。方法选择SD雄性大鼠40只，随机分为实验组和对照组，每组20只。实验组建立VC模型，对照组不缩窄精索静脉。造模后12周，检测两组睾丸组织内雄激素结合蛋白、抑制素B和睾酮浓度。结果两组睾丸组织雄激素结合蛋白表达情况比较差异无统计学意义(P>0.05);实验组抑制素B及睾酮水平均低于对照组(P<0.05)。结论VC可使睾丸支持细胞抑制素B和睾酮分泌减少，影响精子发育、成熟，导致男性不育。

[关键词]精索静脉曲张；不育,男性；雄激素结合蛋白质；抑制素类；睾酮;大鼠,Sprayue-Dawley

精索静脉曲张(varicocele， VC)是男性常见疾病，男性不育症患者中VC占19%～41%[1]。VC导致不育的原因众多，迄今为止，相关领域的研究主要是对血清抑制素B及睾酮水平的测定，而对于其在睾丸组织中表达情况的研究较少，且对于雄激素结合蛋白的研究也较少见报道。笔者通过研究VC对大鼠睾丸支持细胞雄激素结合蛋白、抑制素B及睾丸组织内睾酮分泌水平的影响，旨在探讨男性不育的发生机制。

1材料与方法

1.1实验动物及模型制备

1.1.1动物选择及分组:选择SD雄性大鼠40只，购自河北医科大学实验动物中心，鼠龄(50±10)d，体重240～280 g。将大鼠随机分为实验组和对照组，每组20只。所有大鼠在相同条件下自由饮食、水饲养3个月。

1.1.2模型制备方法：参考Turner[2]的方法。实验组给予10%水合氯醛麻醉，打开腹腔后分离出左肾静脉，于左肾静脉与下腔静脉间放置一直径0.8 mm的注射器针头，在交叉处用3-0丝线将针头与左肾静脉一并结扎，可缩窄左肾静脉直径，然后抽出注射器针头，用生理盐水冲洗腹腔后缝合切口。对照组不缩窄左肾静脉，其余步骤同实验组。两组均于术后腹腔注射青霉素20万单位/d，连续3 d。以精索静脉最大直径>1 mm,左右肾重量无明显差别为模型建立成功。

1.2标本采集和检测

1.2.1标本采集和切片制备：参考冯栋栋[3]的方法。操作步骤：造模后12周，10%水合氯醛腹腔麻醉后打开腹腔，暴露双侧肾脏，将左侧睾丸上推入腹腔，观察睾丸大小，将睾丸和附睾一并剪下，剪除附睾及筋膜等附属组织，用冷盐水洗净，滤纸吸干。将睾丸平均切成两半，一半剪除白膜后称重，放入玻璃匀浆器中，按1∶2(重量∶体积)比例加入磷酸缓冲液后研磨，4℃过夜，次日以3000 r/min离心15 min,取上层液置Eppendof管于-20℃保存待测。另一半睾丸组织置于10%中性甲醛溶液中固定24 h,切成1～2 mm薄片，梯度乙醇脱水，二甲苯透明30 min,石蜡包埋。切片厚4 μm于60℃温箱中烘干。

1.2.2标本检测

1.2.2.1睾丸组织内雄激素结合蛋白及抑制素B的检测及结果判定：参考冯栋栋[3]报道的方法。步骤：将4 μm厚的切片置于载玻片上60℃过夜。切片浸于二甲苯5 min×2次，100%、95%、90%、85%、75%乙醇5 min×2次;1%甲醇过氧化氢溶液，室温10 min,蒸馏水洗1次，0.1 mol PBS洗3次×5 min；切片上滴加抗原修复液，室温10 min,0.1 mol PBS洗3次×5 min；切片上滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min。去掉多余液体，不洗；切片上滴加第一抗体4℃过夜，0.1 mol PBS洗3次×5 min；切片上滴加生物素化第二抗体(IgG)，37℃ 20 min，0.1 mol PBS洗3次×5 min；切片上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37℃ 20 min，0.1 mol PBS洗3次×5 min；使用DAB显色试剂盒1 ml蒸馏水加显色剂A、B、C，混匀加至标本显色6 min，充分水洗；苏木素复染细胞核1 min，充分水洗、1%盐酸乙醇分化、1%胺水反蓝、充分水洗、经梯度乙醇脱水、二甲苯透明5 min 2次，中性树脂封片。随机选取5个视野图像，雄激素结合蛋白阳性表达的生精上皮作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。根据阳性细胞密度评分：0分为无阳性细胞；1分为1%～10%；2分为10%～50%；3分为50%～80%；4分为80%～100%。阳性细胞着色强度评分：0分为阴性；1分为轻度着色(浅棕黄色)；2分为中度着色(棕黄色)；3分为强染色(深棕黄色)。着色密度和强度乘积为最终评分[4]。

1.2.2.2睾丸组织内睾酮测定:使用BECKMAN COULTER DXⅠ 800 全自动免疫分析仪测定。步骤同睾丸组织内雄激素结合蛋白及抑制素B检测方法。

2结果

2.1雄激素结合蛋白术后12周，大鼠左侧睾丸组织雄激素结合蛋白免疫组化评分中位数和四分位数间距实验组分别为6.00和4.25分，对照组分别为6.00和4.50分，差异均无统计学意义(P>0.05)。大鼠睾丸组织内雄激素结合蛋白表达情况见图1。

图1　大鼠睾丸组织内雄激素结合蛋白表达情况(DAB×400)

2.2抑制素B术后12周，大鼠左侧睾丸抑制素B免疫组化评分中位数和四分位数间距实验组分别为5.00和2.00分，对照组分别为7.50和4.50分，差异有统计学意义(P<0.05)。大鼠睾丸组织抑制素B表达情况见图2。

2.3睾酮水平术后12周，大鼠左侧睾丸组织匀浆提取液睾酮浓度实验组为(94.79±3.31)nmol/L，对照组为(109.10±6.37)nmol/L，差异有统计学意义(P<0.05)。

图2　大鼠睾丸组织抑制素B表达情况(DAB×400)

A.实验组高表达;B.实验组低表达;C.对照组高表达;D.对照组低表达

3讨论

夫妻双方同居>1年未采用任何避孕措施，且由于男方因素导致女方不孕者，称不育[5]。VC对于支持细胞的功能损害是导致不育的重要环节[6]。VC发病原因一般分为两种，原发性和继发性，其中，原发性VC可由于静脉内压力过高引起，包括左侧精索静脉呈直角汇入左肾静脉，肠系膜上动脉与腹主动脉压迫左侧精索静脉，左侧精索静脉内瓣膜缺失、关闭不全等，精索内静脉周围结缔组织薄弱及静脉瓣膜功能障碍、关闭不全，精索静脉管壁组织结构异常，精索静脉解剖变异，提睾肌发育不全等解剖学因素或发育不良引起[7]。继发性VC原因最常见的为腹膜后肿瘤、异位血管压迫、肾脏积水或肿瘤等。无论VC属于何种类型，均可导致阴囊潮湿、坠胀、睾丸疼痛且向下腹部、腹股沟区或腰部放射，尤以长时间站立或劳累后症状更明显，反之，休息或平卧后上述症状均可得到不同程度的缓解。

VC导致不育的原因目前尚不明确，但其机制的研究仍在不断进行，目前比较流行的学说包括：一氧化氮机制、睾丸微循环障碍机制、肾脏及肾上腺代谢产物反流机制、凋亡机制等，均能从不同角度解释VC导致睾丸生精障碍及精子活力减低等现象。近年来，在VC导致男性不育方面的研究取得重要进展的是生精细胞凋亡异常。在生精过程中，25%～75%生精细胞发生凋亡。生精功能障碍与凋亡异常密切相关。患者的睾丸间质细胞、生精细胞凋亡指数与梗阻性无精症患者比较明显升高，在VC导致不育中，生精障碍的严重程度与其凋亡指数呈正相关，而生精细胞凋亡与生精细胞损害程度有关。

支持细胞对生精细胞的作用除维持局部免疫、营养支持外，还能维持生精细胞发育。其中分泌的雄激素结合蛋白与抑制素B对于睾丸生精功能维持和调节有显著作用[8]。睾丸支持细胞侧面和近腔面凹陷分为基底室和近腔室[9]。近腔室位于精原细胞上方，通向生精小管管腔，内有精母细胞和精子细胞。基底室靠近基底膜，内有精原细胞[10]。

雄激素结合蛋白是一种分子量为85 KD的异二聚体糖蛋白，与雄激素共同参与性功能的维持作用。有研究表明，VC大鼠睾丸组织中雄激素结合蛋白含量较对照组低，但差异无统计学意义[11]。一些研究表明，大鼠睾丸组织中支持细胞和雄激素结合蛋白缺乏，即使精子数量不减少，但仍可导致大鼠不育，提示雄激素结合蛋白表达异常对精子的数量和质量有重要影响[8]。本研究结果表明，实验组术后12周，睾丸组织中雄激素结合蛋白表达减少，但与对照组比较差异无统计学意义，可能的原因为VC导致睾丸局部损伤因子增加对支持细胞的直接损害作用及上述代偿机制的共同作用，并且与VC严重程度及病程有关。

抑制素分为两种类型，即：抑制素A和抑制素B，其中后者为作用的主要形式。在男性中抑制素由睾丸支持细胞分泌，主要作用是通过对下丘脑-垂体-性腺轴的负反馈调节作用，从而间接影响睾丸间质细胞对睾酮的分泌，抑制促卵泡激素(FSH)分泌，还能促进cAMP途径对间质细胞的功能[12]。本研究结果发现，术后12周，实验组睾丸组织内抑制素B表达较对照组降低，提示VC时睾丸支持细胞抑制素B表达减少，导致精子发育、成熟障碍，使睾丸生精功能降低。

在男性中睾酮是由睾丸间质细胞合成分泌，生精小管内高浓度的睾酮对生精功能的维持具有重要作用[13]。睾酮对生精细胞的直接作用是通过膜效应刺激生精细胞的发育，并且抑制Fas的表达而促进生成精子[14]。本研究结果显示，VC大鼠实验组术后12周时睾丸组织中睾酮水平低于对照组，提示VC可通过内分泌调节导致睾丸中内源性睾酮减少，影响精子发育成熟，最终引起不育。

综上所述，VC导致睾丸支持细胞内抑制素B及内源性睾酮减少，影响精子生成、发育，可能是其导致男性不育的主要机制。

[参考文献]

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(收稿时间：2014-12-27修回时间：2015-01-30)

论著·

Effect of Varicocele on Testicular Endocrine Function in Rats

MIAO Rui1, JIA Xiao-peng2, LI bin3, GUO Jing1, SUN Yun-chao4, FENG Dong-dong5(1. Department of Obstetrics and Gynecology， Bethune International Peace Hospital of PLA， Shijiazhuang 050082， China； 2. Department of Urinary Surgery， the Third Hospital of Hebei Medical University， Shijiazhuang 050051， China； 3. Department of Urinary Surgery， the Worker's Hospital of Tangshan, Tangshan, Hebei 063000, China； 4. Department of Surgery, Hebei Provincial Hospital of Chinese Traditional Medicine, Shijiazhuang 050011, China; 5. Department of Urinary Surgery， Hospital of Integrated Chinese Traditional and Western Medicine of Zibo City, Zibo, Shandong 255000, China)

[Abstract]ObjectiveTo study the effect of varicocele (VC) on secretary function of the sertoli cells in rats. MethodsA total of 40 Sprague-Dawley male rats were randomly divided into experiment group (n=20) and control group (n=20). The experiment group established VC models, while the control group did not receive spermatic vein coarctation. The levels of androgen binding protein, inhibin B and testosterone concentration in testicular tissues were detected in the two groups 12 weeks after the model establishment. ResultsThe difference in androgen binding protein expression was not statistically significant in the two groups (P>0.05); the levels of inhibin B and testosterone concentration in experiment group were more reduced than those in control group (P<0.05). ConclusionVC can reduce secretion levels of inhibin B and testosterone concentration of testicular support cells, and then interfere with mature and development of the spermatozoa, which may induce male sterility.

[Key words]Varicocele; Infertility, male; Androgen-binding protein; Inhibins; Testosterone; Rats, Sprayue-Dawley

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.05.009

[文献标志码][中国图书资料分类号]R697.24A

[文章编号]2095-140X(2015)05-0029-04

[基金项目]河北省人口和计划生育委员2012年科研计划课题(2012-A09)