MMP-2 基因多态性与动脉粥样硬化性脑梗死初发及复发相关性研究

李 凤，陈 明，喻 明，李琳琳，聂本刚

脑梗死是指脑部血液供应障碍，脑组织缺血缺氧导致坏死，从而出现相应的神经功能缺损，占全部卒中的60%～80%［1］，动脉粥样硬化是其最常见的病因［2］。首发的脑梗死患者，能及时治疗，多数能够进入到恢复期和后遗症期继续治疗，而脑梗死一旦复发，其症状重于初发，愈发难治并危及生命。在我国，脑梗死5 y 内的平均复发率高达40%以上。如何防止脑梗死复发，是当今国内外研究的一个重要课题。脑卒中与遗传多态性的研究是近年生命科学研究的热点和重点。家族聚集性研究、双生子研究、家系的复合分离分析和遗传模式分析等多种研究方法结果表明脑卒中符合多基因遗传方式，尽管国内、外已广泛开展该病的分子遗传学研究，但得到公认的阳性结果不多，各研究结论亦难以互相重复或验证［3］。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一种可降解细胞外基质的钙锌离子依赖性蛋白酶，一直被认为是动脉粥样硬化发病中的一种重要炎症介质，可促进动脉粥样硬化的发生与发展。MMP-2 是MMPS 家族的主要成员，与缺血性脑卒中的发生发展密切相关［4］。而MMP-2 基因1306C/T 和735C/T 多态性与动脉粥样硬化有关，基因失活对轻微损伤引起的血栓形成有保护作用，并中度延长出血时间［5］。目前国内外尚未见MMP-2 基因1306C/T 和735C/T 多态性与动脉粥样硬化性脑梗死初发及复发的相关性研究的文献报道。本研究旨在探讨MMP-2 基因1306C/T 和735C/T 多态性与动脉粥样硬化性脑梗死初发及复发的相关性，为脑梗死的预防及治疗提供新的理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 筛选2012 年4 月～2014 年4月在本院神经内科连续住院的脑梗死患者。入选方法:(1)初发脑梗死患者:在我院住院，确诊为首次发生脑梗死患者;(2)复发脑梗死患者:在我院住院患者，既往有脑梗死病史;(3)正常健康组:在我院体检科体检的正常人群。入选标准:全部入选病例符合1995 年全国第四届脑血管病学术会议制定的诊断标准［5］，年龄≥18 岁，脑梗死发病3 d 内入院，并经临床、头部CT 和/或MRI 扫描确诊，所有病例组行颈部血管彩超检查，部分患者行头部MRA 检查，根据TOAST 分型标准［6］选出大动脉粥样硬化性脑梗死患者。其中复发性脑梗死同时需满足:(1)出现新的神经功能缺损症状;(2)初发症状加重，距第一次梗死时间大于一个月，排除进展性卒中;(3)影像证实有新的缺血病灶。排除标准:(1)不合作者，患者或家属不同意参与该研究或拒绝留取标本;(2)有动脉炎和其他血管炎、脑动脉畸形和心源性脑栓塞;(3)有严重的呼吸系统感染或其他严重感染疾病;(4)有严重的肝脏疾病和(或)肝功能损害者;(5)有严重的肾脏疾病和(或)肾功能损害者，经肾功能检查提示Cr ＞220 μmol/L;(6)有严重贫血者，经血常规检测提示Hb ＜80 g/L，或者凝血功能障碍或其他严重的血液系统疾病;(7)近期有外伤史、手术史、妊娠史、传染性疾病以及寄生虫疾病史;(8)近6 个月来有服用降脂药治疗和(或)雌激素及避孕药史;(9)有严重的内分泌疾病、自身免疫性疾病和(或)恶性肿瘤。所有研究对象间无血缘关系，在纳入研究前每位入组者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 实验方法 所有患者于入院次日清晨空腹抽血检测血糖、血脂等水平，酶联免疫吸附法(美国R＆D 公司试剂盒)检测血清MMP-2 水平。MMP-2 基因1306C/T 和735C/T 多态性检测采用PCR 限制性片段长度多态性技术。(1)DNA 提取:清晨空腹抽取的肘静脉血置于抗凝管中，-80 ℃冰箱冻存。采用血液基因组提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)抽提基因组DNA。(2)引物的设计及合成:运用Primer5.0 软件(加拿大Premier公司)进行引物设计，由上海生物工程有限公司合成。MMP-2 基因735C/T 上游引物序列:5’-ATCCTGTGACGGAGAATG-3’，下 游 引 物 序 列:5’-TAAAATGAGGCTGAGACC-3’，扩增片段长度为164 bp。MMP-2 基因1306C/T 上游引物序列:5’-CTTACCCCGAGTCCTATCTGCC-3’，下游引物序列:5’-TCTTGGGAACGCCTGACTTCAG-3’，扩增片段长度为193 bp。(3)PCR 反应条件95 ℃5 min，(94 ℃45 s，56℃ 30 s，72 ℃ 35 s) × 30 cycles，72 ℃10 min。PCR 反应体系为10 ×buffer 2 μl，dNTP(各10 mmol/L)1 μl，上下游引物各1 μl，DNA 模板0.1 μg，DNA 聚合酶2 U，加ddH2O 至总体积20 μl。反应结束后，经2%琼脂糖凝胶电泳分析，凝胶成像仪检测PCR 产物特异性，PCR 纯化试剂盒(德国Qiagen 公司)纯化PCR 产物。(4)酶切反应:反应体系包括PCR 纯化产物1 μg，10 ×buffer 1 μl，XspⅠ内切酶1.5 U(1306C/T)或HinfⅠ内切酶1.5 U(735C/T)(New England Biolabs 公司)，加ddH2O 至10 μl 体积，置于37 ℃酶切16 h，经2%琼脂糖凝胶电泳分析，凝胶成像仪判定结果。

1.2.2 统计方法 所有数据运用SPSS 17.0统计软件，釆用Hardy-Weinberg 平衡法检测样本的群体代表性。所测数值以均数±标准差()描述，计数资料以百分率(%)表示，各组之间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)的多个样本均数两两比较法(LSD 法)，两样本均数比较采用成组设计的两样本均数比较(t 检验)，并以比值比(odds ratio，OR)及其95%的置信区间(confidence index，CI)表示相对风险度。综合评价各因素与初发脑梗死、复发脑梗死的相关性采用多因素Logistic 回归分析。P ＜0.01，差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般临床资料 最终入组初发脑梗死350 例，复发脑梗死340 例，正常健康组(对照组)360 例。3 组一般临床资料比较如下(见表1)。

2.2 3 组血清MMP-2 水平的比较 初发脑梗死组及复发脑梗死组血清MMP-2 水平显著高于对照组，且复发脑梗死组高于初发脑梗死组［(3.32 ±0.94)vs (2.93 ±0.53)mg/L，P ＜0.01］。以表1中所有的变量作为自变量(有=1，无=0)，是否发生脑梗死为因变量(发生脑梗死=1，对照组=0)进行Logistic 回归分析，结果显示血浆MMP-2 水平增高不是发生脑梗死的独立危险因素(OR 0.820，95%CI 0.620～1.058，P ＞0.01;OR:0.719，95%CI:0.528～1.016，P ＞0.05)。

2.3 3 组MMP-2 基因多态性检测结果 对照组、初发脑梗死组及复发脑梗死组人群MMP-2 基因1306C/T(χ2=0.523，P ＞0.05)和735C/T(χ2=0.891，P ＞0.05)多态性分布符合Hardy-Weinberg平衡，具有群体代表性。(1)3 组MMP-2 1306C/T基因型(χ2=1.075，P ＞0.01)和等位基因(χ2=1.124，P ＞0.01)的频率分布无统计学意义(见表2)，PCR 扩增产物经XspⅠ内切酶酶切为CC 基因型可见188 bp 的基因片段，CT 型可见188、162 bp2个基因片段，TT 基因型可见162 bp 的基因片段。(2)735C/T 基因:PCR 扩增产物经HinfⅠ内切酶酶切为3 种基因型:纯合子C/C(仅有164 bp 一条带);杂合子C/T(可见164 bp、143 bp、68 bp3 条带)，纯合突变子T/T(可见143 bp、68 bp 两条带)。复发脑梗死组C 等位基因频率明显升高，与初发脑梗死组相比(92.5% vs 87.9%，χ2=4.398，P ＞0.01)差异无统计学意义，但与对照组相比(92.5%vs 78.5%，χ2=8.121;P ＜0.01)差异有统计学意义;初发脑梗死组与对照组相比(87.9% vs 78.5%，χ2=4.121;P ＞0.01)差异无统计学意义(见表3)。以MMP-2 735C/T 基因型作为自变量(CC=1，CT=0)，是否发生脑梗死为因变量(发生脑梗死=1，正常对照组=0)进行Logistic 回归分析，MMP-2 735C/T 多态性是脑梗死复发的独立危险因素(OR:1.765，95%CI:1.177～2.676，P=0.006)。

表1 研究对象的一般资料比较

表2 3 组人群MMP-2 1306C/T 基因型及等位基因频率分布(例，%)

表3 3 组人群MMP-2 735C/T 基因型及等位基因频率分布(例，%)

3 讨论

脑梗死是一个多基因遗传疾病，到目前为止关于脑梗死确切的发病机制及病理生理过程仍然不清楚。随着生活水平的提高及人口老龄化的加剧，脑梗死发生及复发越来越多。目前如何防止脑梗死发生及复发存在很大的问题。已有的研究［7，8］发现MMP-2 与血管再生、炎性反应存在密切相关性，在脑梗死的发生发展中起重要的作用。MMP-2 可特异性的降解胶原、弹性蛋白和纤维蛋白，削弱动脉粥样硬化斑块的稳定性，裂解基底膜及血脑脊液屏障，参与血管内膜的聚集、浸润和活化，从而导致动脉粥样硬化斑块破裂，参与梗死后炎症反应、继发性脑损伤及损伤的神经修复过程［9］。Brouns 等发现脑梗死患者在急性期MMP-2 明显增加，促进细胞外基质降解，造成血脑屏障开放和血管通透性增加，导致血管源性脑水肿［10］。Halder 等则发现MMP-2 水平与脑梗死后神经功能缺损程度之间呈现出一定相关性［11］。Stemlich等发现MMP-2 在脑卒中发生的4 个月甚至数年后仍然表达增高［12］。本研究显示两组动脉粥样硬化性脑梗死组患者的血清MMP-2 水平均显著高于正常组，且复发脑梗死组高于初发脑梗死组，提示MMP-2 参与了脑梗死的发生，与先前的研究相一致。

人类MMP-2 基因位于染色体16q13～21，分子量为72 kD，包含13 个外显子和12 个内含子。已发现在MMP-2 基因中存在多个序列变异，其中关于1306C/T 和735C/T 多态位点的研究报道较少。MMP-2 1306C/T 和735C/T 多态变异性是指MMP-2基因转录启动子上游的1306 处和735 处存在的C被T 取代。启动子直接参与基因的转录调控，这些多态性的发生可能会对MMP-2 的转录能力产生直接的影响。MMP-2 1306C/T 存在的连锁不平衡现象导致了1306T 单体型的出现，与1306T/735T 单体型相比，携带1306C/735C 单体型的组织中MMP-2 mRNA 水平明显增高。以往的研究对735C/T 进行功能分析后发现735C→T 改变了Sp1(CCACC 盒)的结合位点，从而导致基因的转录活性降低。认为MMP-2 基因的多态性影响血清MMP-2 的水平，进而影响了疾病的发生发展。Manso［13］等发现MMP-2 基因多态性与脑梗死3 个月后的转归相关。另外的研究则发现在动脉粥样硬化的早期阶段，即血管重建和血管增厚发生时，MMP-2 1306C/T 和735C/T 位点的多态性与颈动脉内膜中层厚度无直接关系。本研究发现MMP-2 基因1306C/T 的基因型和等位基因的频率分布在3 组之间比较差异无统计学意义(P ＞0.01)。而MMP-2 基因735C/T 的CC 基因型和C等位基因频率在脑梗死组明显高于对照组，且复发脑梗死组高于初发脑梗死组，差异有统计学意义(P＜0.01)，提示MMP-2 735C/T 的C 等位基因可能是脑梗死复发的潜在危险因素。推测其中可能的机制为MMP-2 735C/T 的C 等位基因频率在复发脑梗死组明显高于另外两组，致使基因转录活性增加，引起梗死区MMP-2 表达上调，在局部聚集的MMP-2 一方面通过降解血管壁细胞外基质，诱导巨噬细胞增值形成泡沫细胞引起血管壁的炎性反应，促进动脉粥样硬化斑块形成;另一方面还可破坏斑块表面的纤维帽，促进动脉粥样斑块的破裂，继发血栓形成和机化导致动脉粥样硬化损伤的快速进展和斑块扩大，造成再次脑梗死。同时，脑血脑屏障破坏、血管通透性增高、局部升高的MMP-2 进入外周循环系统，致使血清MMP-2 水平也升高。

综上所述，本研究结果表明MMP-2 基因735C/T的C 等位基因是脑梗死遗传易感基因之一，可能是脑梗死复发的潜在危险因素。本实验存在样本量偏小等不足之处，继续收集临床病例扩大样本量将有助于进一步了解MMP-2 基因多态性与脑梗死的关系，为脑梗死的预防和治疗提供新的理论依据。

［1］中华医学会神经病学分会脑血管病学组急性缺血性脑卒中诊治指南撰写组.中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010［J］.中华神经科杂志，2010，43(2):146.

［2］Daskalopoulou SS，Daskalopoulos ME，Perrea D，et al.Carotid artery atherosclerosis:what is the evidence for drug action［J］.Curr Pharm Des，2007，13(11):1141 -1159.

［3］Mukherjee D，Patil CG.Epidemiology and the global burden of stroke［J］.World Neurosurg，2011，76(6 Suppl):85 -90.

［4］Stylianou IM，Bauer RC，Reilly MP，et al.Genetic basis of atherosclerosis:insights from mice and humans［J］.Circ Res，2012，110(2):337 -355.

［5］Wagsater D，Zhu C，Bjorkegren J，et al.MMP-2 and MMP-9 are prominent matrix metalloproteinases during atherosclerosis development in the Ldlr(-/-)Apob(100/100)mouse［J］.Int J Mol Med，2011，28(2):247 -253.

［6］中华医学会神经科学会.各类脑血管病诊断要点［J］.中华神经科杂志，1996，29:379.

［7］Han SW，Kim SH，Lee JY，et al.A new subtype classification of ischemic stroke based on treatment and etiologic mechanism［J］.Eur Neurol，2007，57(2):96 -102.

［8］Jacob-Ferreira AL，Schulz R.Activation of intracellular matrix metalloproteinase-2 by reactive oxygen-nitrogen species:Consequences and therapeutic strategies in the heart［J］.Arch Biochem Biophys，2013，540(1):82 -93.

［9］熊光润，王庆海，王桂祥，等.基质金属蛋白酶-2 及其抑制剂与颈动脉粥样硬化斑块易损性的关系［J］.中华神经医学杂志，2009，8(7):691.

［10］Brouns R，Wauters A，De Surqeloose D，et al.Biochemical markers for blood-brain barrier dysfunction in acute ischemic stroke correlate with evolution and out-come［J］.Eur Neurol，2011，65(1):23-31.

［11］Halder AK，Saha A，Jha T.Exploring QSAR and pharmacophore mapping of structurally diverse selective matrix metalloproteinase-2 inhibitors［J］.J Pharmacol，2013，65(10):1541 -1554.

［12］Stemlicht MD，Werb Z.How matrix metalloproteinases regulate cell behavior［J］.Annu Rev Cell Dev Biol，2001，17(3):463 -516.

［13］Manso H，Krug T，Sobral J，et al.Variants of the Matrix Metalloproteinase-2 but not the Matrix Metalloproteinase-9 genes significantly influence functional outome after stroke［J］.BMC Med Genet，2010，11(1):40 -42.